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辛伐他汀对成骨细胞早期粘附与分化的影响(3)

时间:2021-07-01 20:29来源:毕业论文
①同时把1.5 g的碳酸氢钠,0.33 g的谷氨酸和一包DMEM粉末溶于适量三蒸水中,并摇匀,再用容量瓶定容到1L; ②再将培养基的pH用稀盐酸调节到7.2; ③放在

    ①同时把1.5 g的碳酸氢钠,0.33 g的谷氨酸和一包DMEM粉末溶于适量三蒸水中,并摇匀,再用容量瓶定容到1L;

    ②再将培养基的pH用稀盐酸调节到7.2;

    ③放在4℃ 的条件下,静置过夜;

④用二蒸水和三蒸水先后把滤器清洗烘干;

⑥再放在121℃ 温度下灭菌30分钟,以备用;

    ⑤用滤器过滤培养基,分别装到无菌100 mL的玻璃瓶当中,每瓶装90mL,保存在4℃温度下,以备用。

1.3.2细胞培养

①将SD大鼠(新生24小时内)浸泡在配置好的 75% 无水乙醇中,浸泡 5-10 分钟;

②用眼科剪剪下头部,用镊子和剪头小心分离新生鼠的头盖骨;

③用PBS缓冲液冲洗、小心去除新生鼠头盖骨上的软组织;

④去除后再用PBS缓冲液冲洗干净;

⑤将新生鼠头盖骨放置在血清中,并剪碎为 1 mm × 1 mm 的小块;

⑥再将小块转移至培养瓶中,加入 5ml DMEM 高糖培养基; 

⑦将骨片均匀的分散,使骨片的一面向上,置于体积分数5% CO2、37℃的CO2培养箱中倒置培养; 

    ⑧过夜后将培养瓶翻面使骨片浸润在培养液中,之后每 2-3天换液;

⑨细胞传至第三代时,取出用于本次实验。文献综述

1.3.3成骨细胞ALP染色的鉴定

     取第3代生长状态良好细胞做染色鉴定,因为碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞前期分化的特殊标志[12]。所以通过碱性磷酸酶染色来鉴定成骨细胞的纯度。

步骤如下所示:

   ①将第3代细胞固定后,用适量的洗涤液洗涤3-5分钟,再重复洗3-5次;

   ②按下面参数比例,配制BCIP/NBT染色工作液:

碱性磷酸酯酶显色缓冲液 3ml 10ml 

BCIP溶液(300X) 10μl 33μl 

NBT溶液(150X) 20μl 66μl 

BCIP/NBT染色工作液 3.03ml 10.1ml 

   ③ 洗涤完之后,吸弃洗涤液,加入BCIP/NBT染色工作液,使细胞充分的覆盖;

   ④ 在室温避光的条件下,培养一段时间,直到显色为预期深浅的颜色;

   ⑤ 吸弃BCIP/NBT染色工作液,再用蒸馏水重复洗涤2次,终止显色反应;

   ⑥ 最后,利用相差显微镜观察。

1.3.4实验分组

   将第3代细胞接种后分成两组:实验组和对照组,实验组给予含辛伐他汀(1×10-7 mol/L)的完全培养液,对照组给予含等量溶剂无水乙醇的完全培养液进行干预,并在相同的条件下进行培养。               

    a.培养1天后取出分别进行细胞的形态观察;来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

    b.分别培养4和7天时对其碱性磷酸酶活性的定量测定。

1.3.5 细胞形态观察(染色)

    ①将细胞(密度2×104 cells/cm2 )接种于24孔板中,培养2天后,用PBS缓冲液清洗2分钟,再重复清洗2次;

    ②用2%戊二醛在4℃ 条件下固定20分钟后,然后用PBS缓冲液清洗2分钟,再重复清洗2次;

    ③用0.2%Triton X-100在4℃ 条件下透膜处理2分钟,再用PBS缓冲液重复冲洗3次;

辛伐他汀对成骨细胞早期粘附与分化的影响(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_77790.html
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