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三种不同引物扩增对猪圆环病毒2型检测敏感性的研究(3)

时间:2018-08-02 13:17来源:毕业论文
1.2 方法 1.2 .1 病毒TCID50的测定 采用常规微量法培养PCV2临床株和PCV2大北农株[5],并通过间接免疫荧光试验测定其TCID50[6]-[7]。 以下操作在超净台或生物安


1.2  方法
1.2 .1  病毒TCID50的测定
采用常规微量法培养PCV2临床株和PCV2大北农株[5],并通过间接免疫荧光试验测定其TCID50[6]-[7]。
以下操作在超净台或生物安全柜中进行:
将PK-15细胞(无PCV1污染)接种于96孔板中,置于37℃、5%CO2 条件下培养约24h,于显微镜下观察,发现单层细胞铺满孔壁即可;吸取2mL无菌DMEM溶液将病毒冻干粉溶解,并做10-1~10-10连续稀释;按稀释度分别接种于96孔细胞培养板上的PK-15单层细胞,每个稀释度做1列(8个细胞孔),设2孔阴性对照(正常的PK-15细胞),置于37℃、5%CO2 条件下培养;约48 h后取出细胞板,倾去其中液体,用无菌PBS洗涤3次,每次5min,再用预冷的甲醇固定20 min;弃去固定液,将96孔板自然晾干,再用无菌PBS洗涤3次,每次5min,自然干燥;将制备的猪源猪圆环病毒2型阳性血清按1 : 1000稀释,分别取50μL加入每孔,37℃水浴1h,用无菌PBS洗涤3次,每次5 min,拍干;将优尔根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗按1:200稀释,分别取50μL加入每孔,37℃水浴45min,用无菌PBS洗涤3次,每次5min,拍干,置于荧光倒置显微镜下观察;按Reed -Muench法计算毒株的TCID50。
1.2 .2  病毒DNA的提取
取2mL无菌DMEM溶液将病毒冻干粉溶解,并作10-1~10-12连续稀释,分别提取DNA:吸取150μL病毒液于1.5mL的EP管中,加入缓冲液GA补足200μL,震荡至彻底混匀;吸取20μL蛋白酶K溶液加入EP管,震荡混匀;吸取200μL缓冲液GB加入EP管,充分颠倒混匀,于70℃放置10min,待溶液变清亮时,瞬时离心除去管内壁水珠;吸取200μL无水乙醇加入EP管,充分震荡混匀15s,此时可能会出现絮状沉淀;将上述所得溶液和沉淀都转移至一个新的吸附柱CB3中,离心(12000rpm,30s),弃废液,吸附柱放回收集管;向吸附柱CB3内加入500μL缓冲液GD,离心(12000rpm,30s),弃废液,吸附柱放回收集管;向吸附柱CB3内加入700μL漂洗液PW,离心(12000rpm,30s),弃废液,吸附柱放回收集管;再加入500μL漂洗液PW重复洗涤一次,并空离心(12000rpm,2min),将吸附柱于室温下放置数分钟,以彻底晾干残余液体;将吸附柱CB3置于新的离心管中,向吸附柱中心部位悬空加入50~200μL洗脱液TE或双蒸水,室温放置2~5min,离心(12000rpm,2min),收集溶液。
提取到的病毒DNA置于-20℃保存备用。 三种不同引物扩增对猪圆环病毒2型检测敏感性的研究(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_20834.html
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