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狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备(4)

时间:2018-08-02 12:48来源:毕业论文
KH2PO4 0.48 g 加ddH2O至2L,调 pH至7.4,室温放置备用。 1.1.3 仪器设备 进口的PCR 反应仪购自德国Eppendorf 公司; 核酸电泳仪购于北京优尔一公司; 紫外凝胶成像


KH2PO4                    0.48 g
加ddH2O至2L,调    pH至7.4,室温放置备用。
1.1.3 仪器设备
进口的PCR 反应仪购自德国Eppendorf 公司;
核酸电泳仪购于北京优尔一公司;
紫外凝胶成像系统和蛋白电泳仪购于BIO-RAD公司;
恒温水浴锅购于上海森信有限公司;
低温台式离心机购自Eppendorf 公司;
美国sonics超声破碎仪。
1.2实验方法
1.2.1 cvs11-M的克隆
1.2.1.1引物
根据 Gen Bank上cvs11毒株M基因(序列号:ADJ29910.1)的核苷酸序列设计引物,筛选后,酶切位点选择BamH I (GGATCC)和Hind III(AAGCTT),引物由上海生工公司合成,引物名称序列见下表。
Primer name    Primer sequence
Primer-F    28a-BamH-M-F: CGCGGATCCATGAACGTTCTACGCAAGATAG
Primer-R    28a-Hind3-M-R: CCCAAGCTTTTATTCTAGAAGCAGAGAAGAG
1.2.1.2 cvs11株M蛋白基因的扩增回收
cDNA制备:
使用Trizol法提取RNA:1)取适量狂犬病病毒液,加入1mL Trizol,轻轻混匀充分;2)加入200μL 三氯甲烷,剧烈震荡15s 后,室温静置2-3min;3)4℃ 12000r/min 离心15min;4)取450μL 上清,加入等体积异丙醇沉淀RNA,稍微混匀,室温放置5min,4℃,12000 r/min 离心10+1min;5)弃去上清后,1mL 70%乙醇处理沉淀(RNA)(上下轻柔颠倒),4℃,7500r/min 离心5min;6)弃去上清;同步骤5);7)弃掉上清,待酒精挥发后,加入15-20μL DEPC水,室温静置10min,取2μL测浓度后立即进行反转录;
反转录:取上述提取的总RNA 1μg,分别向其中加入12μL ddH2O,随机引物1μL,将该混合液混合均匀后,置于65℃水浴锅中孵育5min 后,冰上复性2min。
5×Reaction Buffer                                     4μL
dNTPs (10mM)    2μL
Ribolock RNase Inhibitor      1μL
RevertHid M-Mul VRT       1μL
上述配的体系    12μL
Total Volume    20μL
PCR仪器中扩增循坏参数:25℃ 5min,42℃ 60min,70℃ 5min。cDNA制备完成。接下来进行PCR扩增 狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备(4):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_20830.html
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