2.4.2 构建pUC-lacY载体 12

  2.4.2.1 连接反应体系 12

  2.4.2.2 感受态细胞的制备以及连接产物的转化 12

  2.4.2.3 提取质粒 13

  2.4.3 重组质粒AflII单酶切 13

    2.4.3.1重组质粒AflII单酶切体系 13

    2.4.3.2割胶回收AflII单酶切体系 14

2.4.2 粘性末端的补平 15

2.4.5构建含有突变盒片段的重组质粒 15

2.4.6突变盒片段的PCR扩增 15

  2.4.6.1 含有突变盒片段的重组质粒EcoRI酶切线性化 15

  2.4.6.2 PCR扩增线性化片段 16

2.4.7化学转化突变盒片段入大肠杆菌细胞 17

2.4.8 阳性转化子的验证 18

2.4.9 Xer重组酶系介导的庆大霉素抗性基因的去除 18

3结果与分析 18

3.1 实验方案 18

3.2 实验结果与分析 19

3.2.1 PCR扩增lacY片段 19

3.2.2 构建pUC-lacY载体 20

3.2.3重组质粒的转化与筛选 20

3.2.4提取重组质粒 21

3.2.5重组质粒AflII单酶切 23

3.2.6含有突变盒重组质粒的构建 25

3.2.7突变盒片段的PCR扩增 25

3.2.8化学转化突变盒片段入大肠杆菌细胞 25

3.2.9阳性转化子的验证 26

4 结论与展望 28

4.1 结论 28

4.2 展望 28

致   谢 30

参考文献 31

 1 绪论

1.1 大肠杆菌乳糖操纵子的基本概况

    大肠杆菌乳糖操纵子作为原核生物基因表达调控的经典模式, 成为微生物学、遗传学和分子生物学等生物学教材中均涉及到的重要知识点。乳糖操纵子的调控包括正调控和负调控两种形式，即阻遏蛋白LacI 与操纵基因相互作用的负调控系统(可被诱导物乳糖诱导)，以及cAMP 受体蛋白(cAMP receptor pro-tein， CRP)与 cAMP 形成的复合物 CRP- cAMP 同乳糖操纵子上游调控元件结合的正调控系统。负调控的解除和正调控的存在都是乳糖操纵子表达所必须的[1]。

    细菌相关功能的结构基因常连在一起，形成一个基因簇。它们编码同一个代谢途径中的不同的酶。一个基因簇受到同一的调控，一开俱开，一闭俱闭。也就是说它们形成了一个被调控的单位，其它的相关功能的基因也包括在这个调控单位中，例如编码透过酶的基因，虽它的产物不直接参与催化代谢，但它可以使小分子底物转运到细胞中[2]。

    乳糖分解代谢相关的三个基因，lacZ、Y、A就是很典型的是上述基因簇。它们的产物可催化乳糖的分解，产生葡萄糖和半乳糖。它们具有顺式作用调节元件和与之对应的反式作用调节因子。三个结构基因图的功能是： 利用Red重组技术删除大肠杆菌乳糖通透酶基因(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_44355.html