4、1%木糖标准溶液：精确称取木糖1。0000g，用蒸馏水溶解定容至100ml。

5、磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液（1L）：精确称取91。288g磷酸氢二钾，用蒸馏水溶解后定容至1000ml;精确称取45。644g柠檬酸，用蒸馏水溶解后定容至1000ml；取515ml磷酸氢二钾溶液，485ml柠檬酸溶液混合，调节pH值为5。0。

6、底物采用1%木聚糖溶液：称取木聚糖1。000g，加入80ml配置好的缓冲液，转入容量瓶中，用缓冲液定容至100ml，储存于冰箱中（一般至多使用3天）。

7、3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS）：实验室中保存。

8、50*TAE: 实验室中保存。

2。2。2里氏木霉的培养

2。2。2。1里氏木霉的活化培养

将实验室保藏的里氏木霉菌种接种到PDA固体培养基平板上进行活化培养，培养温度28℃，培养2-3天，待长出菌丝体后，借助解剖刀从平板上切下小块带有菌丝体的培养基，接种到液体木聚糖酶诱导培养基中，放置于恒温摇床中，设置培养温度28℃，160r/min振荡培养。

2。2。2。2里氏木霉中木聚糖酶提取最佳时间的确定

（1）分别吸取诱导培养基培养1、3、6、9、12、24、48、72、96h的培养液；

（2）DNS法测定木聚糖酶

（3）根据测定情况，确定最佳诱导木聚糖酶的时间。

2。2。2。3 DNS法测定木聚糖酶

（1）标准曲线制作：分别吸取1%的木糖标准溶液1。0，2。0,3。0,4。0,5。0,6。0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，稀释成浓度分别为200,400,600,800,1000,1200ug/ml的木糖标准液[14]。分别吸取不同浓度的稀释过的木糖标准液0。5ml于试管中，加入pH为5。0的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液1。5ml，DNS试剂3。0ml，在沸水浴中沸腾5min,取出后加入蒸馏水10ml并摇匀,以蒸馏水0。5ml替代稀释的木糖标准液作对照[19]。冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计测定吸光值。以吸光值为纵坐标，相应的木糖标准液的浓度为横坐标，绘制标准曲线并且计算回归方程[14]。

（2）样品吸光值的测定：吸取稀释过的样品溶液0。5ml，放置于40℃水浴锅中2分钟，加入同样处理的用pH5。0磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液配置的1%木聚糖溶液[20]1。5ml，马上计时，在40℃水浴锅中精确反应10分钟，取出之后迅速加入3。0mlDNS试剂以终止反应，接下来在沸水浴中沸腾处理5分钟，取出之后加入10ml的蒸馏水，冷却后，用分光光度计测定吸光值。同时作空白对照。

（3）利用回归方程，计算木糖含量，确定诱导木聚糖酶的时间。

2。2。3里氏木霉总RNA的提取文献综述

（1）将经过诱导的里氏木霉的菌丝球转入离心管中，用无菌水冲洗三次之后吸净水分；

（2）取30-50mg处理过的菌丝球放入预冷的研钵里，加入液氮之后进行充分的研磨，之后加入1 ml TRIzon Reagent；

（3）加入TRIzon Reagent之后吹打均匀混合，使得样品完全裂解，在室温下放置5分钟至融化，确保蛋白质核算复合物完全分解，转入RNase-Free离心管中；

（4）加入0。2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒,在室温下静置3分钟;

（5）4℃，12000rpm离心10分钟，这时样品分为三层：上层无色水相，中间层和红色有机相，RNA主要存在在上层无色水相中，将上层无色水相转入一个新的RNase-Free离心管中[14]；

（6）在离心管中加入等体积的70%乙醇溶液（用无RNase水配置），上下颠倒混匀；

（7）将（6）中所得溶液全部加入已有收集管的吸附柱中。如果一次不能加完全部溶液。可分多次加入。12000rpm离心20秒，将收集管中的废液倒尽，吸附柱重新放回； 里氏木霉中木聚糖酶基因的克隆(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_202691.html