摘要：诺如病毒（Norovirus，NV）为杯状病毒科的一个属，变异性高，感染性强，是引起人类病毒性胃肠炎暴发的重要病原。本文主要通过基因工程手段，通过PCR技术， 利用GII.4型诺如病毒主要衣壳蛋白VP1基因特异性引物，克隆出该基因。利用限制性内切酶BglII/EcoRI分别双酶切VP1编码基因和表面展示重组质粒pTrcHisC-inaQ-N-gfp，回收相应片段进行连接，最后将VP1编码基因取代绿色荧光蛋白基因gfp，构建表面展示VP1蛋白的重组质粒pTrcHisC-inaQ-N-gfp。重组质粒构建成功将为进一步展示诺如病毒衣壳蛋白VP1于大肠杆菌细胞表面奠定基础。22631
毕业论文关键词：诺如病毒；衣壳蛋白；VP1；质粒
Construction of cell surface display system using capsid protein VP1 from norovirus
Abstract: Norovirus(NV) is a genus of Caliciviridae. It has high variability and strong infections. It is the most important reasons that cause human viral gastroenteritis. In this study, PCR method was used to clone the capsid protein VP1 from norovirus GII.4 type, using spicific primers. Then, resitrictin enzymes BglII/EcoRI was used to digest VP1 coding sequence and the cell surface display recombinant plasimid pTrcHisC-inaQ-N-gfp, respectively. The DNA fragments were recovered, and the VP1 coding sequence was further replaced the green fluorescent protein coding sequence (gfp). Therefore, the cell surface display recombinant plasimid named pTrcHisC-inaQ-N-VP1 was successfully constructed. This study can contribute to the display of capsid protein VP1 from norovirus on the surface of Escherichia coli。
Keywords: Norovirus; capsid protein; VP1; plasmid
目录
1.前言 1
1.1诺如病毒概述 1
1.2病毒的基因组与遗传 2
1.3病毒的检测方法 3
1.4病毒衣壳蛋白的体外表达技术 4
1.5本研究的目的与意义 4
2.材料设备与实验方法 5
2.1材料 5
2.1.1菌种 5
2.1.2载体与质粒 5
2.1.3试剂 5
2.1.4 培养基与凝胶的制备 6
2.2设备仪器 6
2.3实验方法 7
2.3.1PCR反应 7
2.3.2琼脂糖凝胶电泳 8
2.3.3DNA片段凝胶回收 9
2.3.4质粒的转化 10
2.3.5质粒抽提 10
2.3.6限制性内切酶酶切 11
2.3.7酶切产物的连接 12
3.结果与讨论 12
3.1诺如病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆 12
3.2诺如病毒主要衣壳蛋白VP1展示载体的构建 14
3.3 表面展示重组质粒pTrcHisC-inaQ-N-VP1的验证 16
3.4讨论 17
3.3.1PCR的准备与操作注意事项 17
3.3.2酶切与酶连的注意事项 18
3.3.3电泳过程的注意事项 18
4.结论 19
致谢 19
参考文献 20
1.前言
1.1诺如病毒概述
诺如病毒（NoroViruses，NVs）为杯状病毒科的一个属，是引起人类病毒性胃肠炎暴发的重要病原。由于缺乏有效的细胞培养系统和动物模型，诺如病毒的研究工作受到了一定的限制，目前主要通过基因工程方法进行研究，其中对ORF2 编码的衣壳蛋白研究较多。冷冻电子显微镜和计算机图像处理技术的研究结果表明，衣壳蛋白由180 个分子组成，折叠成90 个二聚体，衣壳蛋白还构成了T =3 的病毒体二十面体立体对称结构，衣壳具有连续的蛋白外壳，半径在10.0-14.5nm 之间，这使得局部产生突起的结构，并具有严格的二重对称轴，向外延伸半径约为19.0nm，在二十面体的5倍和3倍对称轴处留下较大的凹陷。衣壳蛋白分为2个主要的区：S区和P区，两者通过灵活的铰链相连。S区主要涉及到20面体外壳的形成，P区从外壳向外形成突起部分。N 端的225个氨基酸残基构成S区，从225位氨基酸到羧基末端构成P区，P区又分为2个区域，226—278位氨基酸以及406—520位氨基酸构成P1区，而279—405位氨基酸为P2 区，与病毒或细胞RNA的翻译和蛋白合成的调节有关，也是诺如病毒基因组中变异最强的区域。突变分析显示，暴露的P2区表面具有与组织血型抗原（Histoblood Group Antigen,HBGA）结合的功能，这说明此区域含有株特异性决定簇、受体结合位点以及潜在的中和抗体结合位点。免疫压力以及HBGA-受体相互作用可能促进P2区末端和暴露的P1区残基的进化，导致衣壳蛋白结构的变化，并产生新的亚型[1]。 诺如病毒衣壳蛋白VP1细胞表面展示体系的构建:http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_15328.html