表 1。1 CRISPR-Cas 系统亚型[28]

Type

Type hallmarks

Subtype

Subtype hallmarks

crRNA processing

Effector complex Targeted

nucleic acid

I

Cas3 I‑A Cas8a Cas6 homologues,

Cascade

Cascade

DNA

I‑B Cas8b

I‑C Cas8c, repeat group 3 Cas5d

I‑D Cas10

Cas6 homologues

I‑E Cse1, repeat group 2

I‑F Csy1, repeat group 4

II Cas9, repeat

group 10 II‑A Csn2

RNase III, unknown nuclease

Cas9

II‑B Cas4

II‑C lack of Csn2 and Cas4

III

Cas10 III‑A Csm2 Cas6 homologues, Csm Csm

III‑B Cmr5 Cas6 homologues, Cmr Cmr RNA

其中 II 型 CRISPR/Cas 系统最为简单便捷，仅需要 Cas9 蛋白核酸酶就能进行切割工 作，而非另外两种系统，不需要形成多 Cas 蛋白复合体，所以 II 型 CRISPR/Cas 系统的 使用最为广泛，Cas9 蛋白是其核心，用于切割 DNA 双链[18] 。文献综述

1。4。3 CRISPR 系统作用机制

经过研究发现，CRISPR 系统作用机制主要分为以下三个阶段：

① 适应阶段

在适应阶段， CRISPR 基因座从细菌或古细菌获得中间隔序列（spacer）。在噬菌 体或质粒初次入侵时，CRISPR 系统可以识别其携带的 PAM 序列，并且在 Cas1 和 Cas2

第 6  页 本科毕业设计说明书

蛋白的共同作用下，以非同源重组的方式将其整合到宿主基因组 CRISPR 位点的 5’端， 插入在前导序列 LS 与第一段重复序列 DR 之间，形成 R-S 结构，因此，CRISPR 基因 座就获得了外源噬菌体或质粒的序列，这是获得性免疫的基础步骤。

② 表达阶段

在表达阶段，CRISPR 基因座表达产生成熟的 crRNA。首先，CRISPR 基因座上游 的前导序列 LS 启动转录，产生 CRISPR RNA 前体（pre-crRNA），而其后 pre-crRNA 的加工过程则随 CRISPR 系统的类型而异。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

在Ⅰ型和Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统中，pre-crRNA 的前期生成是在 Cas6 蛋白以及其 他蛋白结构域组成的 Cascade 复合体的作用下进行的。Ⅰ型系统中 pre-crRNA 经过剪 切生成 crRNA，其 5’端通常有 8 个核苷酸的重复序列，而 3’端通常形成长度随具体类 型而定的发卡结构。Ⅲ型系统中经过剪切后的短 crRNA 在 cas 剪切复合体进行后续的 加工成熟。 利用CRISPR/Cas9构建RIP1基因敲除细胞(5):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_83614.html