质，以便进一步摸索能够分离纯化其活性物质的方法，为进一步的分离纯化作准备。

2材料与方法

2。1 试验材料

 材料和试剂：

马铃薯，葡萄糖，无水乙醇 分析纯 ，HCl 溶液 分析纯，NaOH 分析纯，

    (NH4)2SO4  分析纯，乙酸乙酯，四氯化碳，氯仿，苯，正丁醇，水饱和正丁醇，

水饱和正丁醇中含2%的对甲基苯磺酸，丁醇：醋酸：水=2:1:1，水饱和正丁醇含2%的六氢吡啶，正丁醇饱和的0。5 mol/L的pH=7。0磷酸盐缓冲液，正丁醇饱和的水含2%的对甲基苯磺酸，甲醇 ：苯=1 : 4 ，滤纸用0。5 mol/L的pH=7。0 磷酸缓冲液浸泡处理，25%水：75%甲醇，（内含3%氯化钠）滤纸用5%硫酸钠浸泡处理，

pH=8。0的磷酸盐缓冲液的配置：文献综述

      磷酸氢二钠（0。2 mol/L）                81 ml

      磷酸二氢钠（0。2 mol/L）                19 ml

加900 ml灭菌水，放置磁力搅拌器上搅拌使其溶解后，定容至1L。

pH=4。0的磷酸盐缓冲液的配制：

向100 ml的磷酸缓冲液中分别加入18 ml的0。2 mol/L NaAc和82 ml的0。2 mol/L  HAc。

  仪器设备：

超净台，烘箱，恒温水浴锅，超速冷冻离心机，pH测量仪，分液漏斗，层析缸，玻璃点样毛细管，滤纸，电泳仪，磁力搅拌器。

2。2 试验方法

2。2。1 培养基的制备

培养基是按马铃薯200 g、葡萄糖20 g和水1000 ml的比例配制的，将马铃薯切小块放入电磁炉中煮沸30 min，再过滤分装到50 ml的小锥形瓶中，高温121 ℃灭菌20 min。

2。2。2 菌株的发酵培养

在超净工作台中将菌株接种到小锥形瓶中，注意无菌操作，放置30 ℃的恒温箱中

静置培养20 d。

2。2。3 菌丝预处理

将发酵培养好的软毛毛壳菌菌株用漏斗粗过滤，得到菌丝体和发酵液，将发酵液收集于50ml离心管中。再将菌丝体用蒸馏水反复冲洗3次，以达到除去菌丝体上残留发酵液的目的，并收集菌丝体14 g放置离心管中。 

将菌丝平均分成2份，其中称取7 g用5 ml蒸馏水浸泡2 d；另一份放置50 ℃烘箱中烘干后，再用5 ml无水乙醇浸泡2d。将两份浸泡液离心后取上清，置于烘箱烘干并溶于1。4 ml的PBS中，通过MTT法[9]测定其抑制率。

2。2。4 发酵液预处理

将漏斗粗过滤得到的发酵液用直径1 cm的针孔滤器进行过滤，得到较为纯净的发酵液。

（1）加热法处理发酵液

用移液枪取5份1 cm的发酵原液装入1ml离心管中，分别放在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的恒温水浴锅中浸泡30 min,取出后用超速冷冻离心机设置12000 rmp，离心30 min[10-11]，观察沉淀情况，并以未处理的发酵原液作为对照，分别检测其生物活性。

（2）调节变化pH值法处理发酵液

用移液枪分别取10份5 ml的软毛毛壳菌菌株发酵原液装入50 ml离心管中，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH值，所需pH值的范围3~12，用超速冷冻离心机设置12000 rmp，离心30 min，观察沉淀情况，并以未处理的菌株发酵原液作为对照，分别检测生物活性。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

（3）无水乙醇直接沉淀法处理发酵液

    移液枪分别取软毛毛壳菌菌株发酵原液1 ml及无水乙醇5 ml置离心管中，并一

同放置4 ℃冰箱中预冷1 h，取出后将两者搅拌混合均匀，再置于-20 ℃冰箱中至少12 h，取出后用冷冻离心机12000 rmp，离心30 min，分离沉淀及上清。 软毛毛壳菌抗肿瘤活性物质的初步分离(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_82141.html