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模仿细胞穿透肽作用机理的基于胍基修饰PEI的设计合成及转染性能研究(2)

时间:2020-12-01 20:12来源:毕业论文
6 2.1 试剂与仪器 6 2.1.1 实验试剂 6 2.1.2 实验仪器 8 2.2 实验内容 8 2.2.1 胍基化试剂的合成 8 2.2.2 氨基封端聚合物(C-32-NH2)的合成及胍基化修饰 9 2.2.3 聚合物的

6

2.1  试剂与仪器 6

2.1.1  实验试剂 6

2.1.2  实验仪器 8

2.2  实验内容 8

2.2.1  胍基化试剂的合成 8

2.2.2  氨基封端聚合物(C-32-NH2)的合成及胍基化修饰 9

2.2.3  聚合物的合成及其胍基化修饰 11

2.3  结果与讨论 13

2.3.1  各种聚合物的水溶性及转染性能评价表 13

2.3.2  胍基化试剂的合成 14

3.  聚合物作为质粒DNA转染载体的性能研究 19

3.1  实验材料及仪器 19

3.2  实验方法 19

3.2.1  pEGFP质粒转化E.coli. 19

3.2.2  大量pEGFP质粒的制备 20

3.2.3  Polymer/DNA复合物的制备 20

3.2.4  琼脂糖凝胶电泳实验 20

3.2.5  细胞转染实验 21

3.2.6  EGFP的表达及荧光显微镜观察和流式细胞仪分析 21

3.2.7  细胞毒性实验 21

3.3  结果与讨论 22

3.3.1 琼脂糖凝胶电泳实验 22

3.3.2 细胞转染实验 23

3.3.3  细胞毒性试验 24

结    论 25

致谢 26

参考文献 27

1  引言

在过去几十年里,基因治疗作为一种治疗遗传病的潜在方法引起了人们的广泛关注。基因治疗是通过载体将外源基因,基因片断或者寡聚核苷酸引入受感染的细胞内进行适当的表达,以纠正或改善致病基因所产生的缺陷,达到治疗疾病的目的。基因治疗包括三个重要的环节,即治疗性基因,转基因载体和靶细胞。目前它可以用于治疗严重的综合免疫缺陷,囊性纤维化和帕金森综合症,并为癌症治疗提供了传统化疗方法外的新方法。

转染是指通过机械物理化学生物等方法将目标DNA、RNA或蛋白质带入真核细胞中,使其发挥一定的生物学功能,现已成为研究基因表达、基因功能和蛋白质功能的重要手段。当前主要使用的转染系统是物理转染系统(基因枪、电穿孔和裸DNA直接注射),病毒载体和非病毒人工合成的转染载体。其中物理转染系统只能应用于皮肤、肌肉和肝脏等有限几种组织。因此转染载体主要集中于病毒载体系统和非病毒载体系统。

1.1 非病毒基因传递的主要障碍

1.1.1  细胞吸收的体外障碍

1.1.1.1  DNA结合

DNA的大小及其自身的负电荷阻碍了裸DNA通过细胞膜渗透而被细胞摄取。多项研究表明裸DNA可以通过电穿孔,一种“基因枪”,进入细胞,或者直接注入靶细胞[5],然而这些方法的临床应用意义有限。由于裸DNA很容易被核酸酶降解,这就阻碍了裸DNA的全身循环。DNA磷酸骨架上的负电荷能与阳离子分子进行静电相互作用,从而得到电中性的核苷酸。研究表明,尽管制备条件包括DNA浓度,pH,缓冲溶液类型,N/P比都会影响复合物的尺寸,但最关键的影响因素是所用阳离子分子的结构。例如,阳离子低聚物半胱氨酸-精胺-半胱氨酸表现出可逆的结合,从而导致了单个DNA分子的断裂。这类复合物的粒径大小与DNA尺寸的立方根成比例[6]。另一方面,阳离子聚合物通常以更强的方式与DNA相互作用,从而形成了包含多个DNA分子的复合物。该复合物的尺寸取决于阳离子聚合物的物理性质而不是DNA分子的尺寸。但是聚合物并不会影响复合物的形态,例如,由DNA与聚赖氨酸(polylysine, PLL)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)或者各种树枝状聚合物形成的复合物都是直径相似的球形结构。然而复合物的聚集会受到聚合物结构的影响。此外,复合物的尺寸也与聚合物的分子量相关。高分子量的聚赖氨酸(224kDa)与DNA形成的复合物粒径为100-300nm,而低分子量的聚赖氨酸(~4kDa)与DNA形成的复合物粒径为20-30nm[7]。仅仅通过复合物的理化性质预测载体的体内及体外转染效率是不可能的,载体的转染效率还受到载体其他性能的影响,如细胞摄取,内涵体逃逸,核定位等。源]自=优尔^`论\文"网·www.youerw.com/ 模仿细胞穿透肽作用机理的基于胍基修饰PEI的设计合成及转染性能研究(2):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_65488.html

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