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塑化剂对猪卵子质量的毒性作用研究(2)

时间:2018-10-26 15:22来源:毕业论文
邻苯二甲酸二(2-乙基)己基酯(DEHP)是存在于塑化剂中主要的有毒物质,可经过皮肤、肺和胃肠道被机体吸收,胃肠道是目前通常认为的主要吸收途径。通


邻苯二甲酸二(2-乙基)己基酯(DEHP)是存在于塑化剂中主要的有毒物质,可经过皮肤、肺和胃肠道被机体吸收,胃肠道是目前通常认为的主要吸收途径。通过食物摄入少许DEHP(0.64mg/kg)时,DEHP在人体内吸收和分布的时期可持续约4-8h[3]。DEHP进入机体之后,在胰腺酶和肠道内的一些酶的作用下,转变为以邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)为主的单酯。因此在肺脏、肝脏、胰腺、睾丸、肾脏和血液中DEHP都可以被水解为MEHP,部分的DEHP会在24h内经由汗液、尿液或者粪便从体内排出,而MEHP作为其主要代谢产物则会长期蓄积在人体的组织中,生物蓄积时间可长达6个月[4]。
DEHP具有很多潜在的慢性毒性,目前已通过体外细胞实验、动物实验(主要是啮齿动物)等调查方法,证明了DEHP可能引起细胞代谢紊乱、可能造成心血管系统障碍、病毒性肝病、肾功能衰竭,甚至可能致癌[5]。
塑化剂对于家畜家禽的生殖系统有着一定的不良影响。用电镜观察HE染色后的大鼠睾丸,在处理组中发现各级生精细胞产生大量的缺失,生精小管发生严重萎缩,间质细胞异常增生,支持细胞呈空泡状,细胞结构紊乱,未见精细胞,细胞核体积较大,核凹陷严重形状异常,核膜处产生切迹、不光滑,且在核膜下有核异染色质附着,细胞器数量降低,线粒体增多且形态发生改变,细胞出病变。这些结果表明,DEHP可以通过影响睾丸的超微结构来影响睾丸的正常生长,从而影响大鼠的生殖毒性[6]。
关于雌性生殖系统,已有实验证明,2000mg/kg 的DEHP可以减少大鼠雌二醇的合成,改变自然排卵周期发生,延长动情周期,并且产生不排卵的现象,同时卵泡的体积减小,并出现多囊卵巢[7]。体外培养SD大鼠卵泡实验发现,随着升高MEHP的剂量,卵泡发生轮廓不清,内部产生黑色坏死区,卵泡基底膜出现缺失、模糊不清,卵子逸出的现象[8]。MEHP浓度为80 μg/ml时可明显地抑制囊状卵泡的生长与发育[9]。100 μg/ml 的MEHP则可增加卵巢颗粒细胞的凋亡数量,降低卵泡存活率[10]。同时也可使小鼠的闭锁卵泡数提升[11]。添加雌二醇与含DEHP和MEHP 的培养液进行共同培养,可以使DEHP和MEHP对卵泡生长的抑制作用得到一定的拮抗[12]。
然而,有关塑化剂对于猪卵母细胞的危害研究还较少。本课题利用MEHP对猪卵子进行体外培养,检测卵子的颗粒细胞扩散情况、极体排出率、氧化应激水平以及早期凋亡情况,进而总结出塑化剂对于卵子质量的毒性作用。
1  材料与方法
1.1  抗体和试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG):宁波市第二激素厂,Lot.No:091103
人绒毛膜促性腺激素(hCG):宁波市第二激素厂,Lot.No:111215
L-半胱氨酸(cysteine):美国Sigma-Aldrich公司,Cat.No:C7880
表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor,EGF):美国Sigma-Aldrich公司,Cat.No:E5160
青霉素钾(penicillin):山东鲁抗医药股份有限公司,LotNo:S090615
葡萄糖(D-glucose):美国Sigma-Aldrich公司,Cat.No:G7021
二甲亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO):Sigma-Aldrich公司,Cat.No:D2650
组织培养基TCM-199:美国Sigma-Aldrich公司,Cat.No:M-2154
杜氏磷酸盐缓冲液(PBS/DPBS):美国Life Technologies公司,Cat.No:SH30028.01B
透明质酸酶(hyaluronidase):美国Sigma-Aldrich公司,Cat.No:H-3506
石蜡油:美国Sigma-Aldrich公司,Cat.No:M8410
羊毛脂(lanolin):国药集团化学试剂有限公司,Cat.No:69014628
活性氧试剂盒:南京建成生物工程研究所,Cat.No:E004
Annexin V-FITC 早期凋亡试剂盒:南京诺唯赞生物科技有限公司,Cat.No:A211-01/02 塑化剂对猪卵子质量的毒性作用研究(2):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_25046.html
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