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表达IBDVVP2和鸡C3d基因重组火鸡疱疹病病毒的构建(3)

时间:2018-09-20 17:25来源:毕业论文
本试验通过构建哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记表达盒(MCMV gpt - SV40 polyA)以及目的基因表达盒(MCMV - VP2 - C3d - BGHpolyA)的重组火鸡疱疹病毒转移载体


本试验通过构建哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记表达盒(MCMV – gpt - SV40 polyA)以及目的基因表达盒(MCMV - VP2 - C3d - BGHpolyA)的重组火鸡疱疹病毒转移载体并双酶切鉴定,然后将该转移载体与HVT DNA共转染鸡胚成纤文细胞(CEF)。使用霉酚酸(MPA)阻断其核酸代谢途径,经过加压筛选获得重组火鸡疱疹病毒rHVT - VP2 - C3d并鉴定,为下一步IBD基因工程疫苗的制备奠定基础。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1 主要试剂
质粒pMD19 - gpt、质粒pMD19 - VP2 - C3d,均由江苏省农业科学院兽医所生物兽药实验室保存;pMD19 -T Simple Vector质粒购自TaKaRa公司;大肠杆菌DH5α
购自Invitrogen公司;鼠IgG购自武汉博士德公司;MCMV启动子购自南京金斯瑞生物科技公司;Trans2KPlus DNA Marker、质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司;连接试剂盒、2×PCR Mix、EcoRⅠ、XhoⅠ、X - gal均购自TaKaRa公司。胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。DMEM培养基为GIBCO公司产品;小牛血清为浙江天航生物有限公司产品。
1.1.2 SPF鸡胚和病毒
SPF种蛋购自山东育凤农业科技有限公司无特定病原种鸡场,在实验室孵化成11日龄的鸡胚;火鸡疱疹病毒Fc - 126株购自南京天邦生物科技有限公司。
1.1.3 主要仪器设备
纯水仪,双人单面超净工作台,高速台式低温高速离心机,落地式低温高速离心机,二氧化碳恒温培养箱,PCR仪,高速台式离心机,恒温空气浴摇床,旋涡震荡器,电子天平,垂直板电泳系统,滤器,酶标仪,凝胶成像系统,倒置显微镜,倒置荧光显微镜,超声波破碎仪。
1.2重组火鸡疱疹病毒转移载体的构建
1.2.1 重组火鸡疱疹病毒UL45和UL46同源臂的克隆
根据GenBank中已发表的HVT FC - 126的序列,针对其UL45和UL46非必需区分别设计引物,引物R(UL45)和引物F(UL46)有25个碱基反向互补。引物设计分别为:
F(UL45):5 – CGGGGTACCTCAAGTGATACTGCGTGA - 3 (划线部分为Kpn I酶切位点);R(UL45):5 – AGATCTTCCGTCGACGCGTGAATTCTATTTACTCATCGCATTAGAGAGG - 3(划线部分为Bgl II、Sal I、EcoR I酶切位点);
F(UL46):5 -  GAATTCACGCGTCGACGGAAGATCTAAAACACACCTCTAACGGTTAC - 3 (划线部分EcoR I、Sal I、Bgl II 酶切位点)
R(UL46):5 – CTAGTCTAGAATGGAAGAAATTTCCTCC - 3 (划线部分为Xba I酶切位点)
以HVT FC - 126基因组为模板,通过PCR扩增分别得到UL45和UL46基因。 表达IBDVVP2和鸡C3d基因重组火鸡疱疹病病毒的构建(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_23226.html
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