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表达传染性法氏囊病毒VP2和法氏囊素三肽嵌合基因重组火鸡疱疹病毒的构建(3)

时间:2018-09-09 21:04来源:毕业论文
1.2 SPF鸡胚和病毒 9-10日龄SPF鸡胚、火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)Fc126株都是在南京天邦生物科技有限公司购买的,法氏囊AH1株是在自己实验室里分


1.2  SPF鸡胚和病毒
    9-10日龄SPF鸡胚、火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)Fc126株都是在南京天邦生物科技有限公司购买的,法氏囊AH1株是在自己实验室里分离保存的。
1.3  BS10-VP2 基因设计、克隆及表达盒的构建
根据注册的 IBDV VP2 序列设计(GenBank NO. AF362747)设计引物,使用RT-PCR的方法从AH1病毒RNA中扩增完整的IBDV VP2基因。引物序列如下:VP2-F1: 5-ATGGCG AACCTGCAAGATCAAAC-3; VP2-R1: 5-GGGAAGCTTCTACTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGT CTTTG-3。
本项目采用密码子排列顺序构成BS基因:5'-AAGCATGGC-3’。设计并合成基因片段BS10-F1、BS10-R1。引物序列如下:BS10-F1: 5-GTCGACATGAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAGCATGGCAAG-3; BS10-R1: 5-TTGCAGGTTCGCCATGCCATGCTTGCCATGCTTGCCATGCTTGCCATGCTTGCCA
TGCTTGCCATG-3。以自身为模板,通过退火的方法将其复性成双链,其PCR产物为编码10个BS三肽的cDNA片段,命名为BS10。
    运用SOE法,以引物BS10-F2、VP2-R2串联BS10基因分别与传染性法氏囊病病毒VP2基因,获得BS10-VP2。引物序列如下:BS10-F2: 5-CTAGCTAGCGTCGTCGACATGAAGCAT-3(含NheI酶切位点); VP2-R2: 5-GGATCCGGGAAGCTTCTACTACC-3(含BamHI酶切位点)PCR产物经纯化后克隆入pMDsimple-19T载体,命名为pMD-BS10-VP2。
    Pec启动子是人工合成,是由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,并将其克隆在载体pUC57中。质粒pMD-BS10-VP2和pUC57-Pec分别通过内切酶NheI, BamHI双酶切、连接,构建表达盒pUC57-Pec-BS10-VP2-polyA。
1.4  重组火鸡疱疹病毒转移载的构建
设计火鸡疱疹病毒HVT非必需区,非必需区UL55~LORF4基因的同源臂AB引物,分别为A-F: 5-CGCGGATCCTTCTTCTTCCCGTTAAAAGGATTTAGGG-3(含BamHI酶切位点); A-R: 5-GCTCTAGAGCGTCGACCGCCGCGGAATTTGTTTAATGTTAGTTTA-3
(含XbaI, SacII酶切位点);B-F: 5-GCCCGCGGAAGTCGACGGAAGCTTCAATT
ATTTTATTTAATAACATATAGCC-3(含SacII、SalI、HindIII酶切位点); B-R: 5-GCTCTAGAGCCATAAACAGCGACGATCGTCTCCAGGATC-3(含XbaI酶切位点)。
提取HVT感染的鸡胚成纤文细胞(CEF)总DNA,分别以A-F、A-R和B-F、B-R引物扩增同源臂AB,回收左/右同源臂A/B的PCR产物,经过2次克隆接获得含有HVT左/右同源臂A/B的克隆质粒pUAB。以pMD-gpt(本实验室构建保存)为模板,PCR扩增出两侧带有SacII和SalⅠ双酶切位点的gpt表达盒 ,经SacII和SalⅠ双酶切回收,克隆到pUAB,获得重组病毒转移载体pUAB-gpt。
利用P3、P4为引物,pUC57-Pec-BS10-VP2-polyA为模板,PCR扩增BS10-VP2基因表达盒,并克隆到pUAB-gpt中,获得重组火鸡疱疹病毒转移载体pUAB-Pec-BS10-VP2-gpt。引物序列如下:P3: 5-GCCAAGCTTAGTTATTAATAGTAATC-3(含HindIII酶切位点); P4: 5-GCGTCGACATGGCGAACCTGCAAGATCAAAC-3(含Sal I酶切位点)。
1.5  重组火鸡疱疹病毒的获得
1.5.1  鸡胚成纤文细胞(CEF)的制备
用10日龄的SPF鸡胚,进行消毒,消毒使用5%碘酊,将蛋壳表面都消毒一遍,然后将鸡胚尽量小心的拿出,并且把它放入装有进行无菌处理过的PBS的平皿内。然后用小剪刀小心的将它的头部,四肢和内脏都去除,再用PBS溶液将剩下的组织器官冲洗,直到外表没有血液,然后将其放入小烧杯中。用外科剪将他们全部剪成1-2mm的小碎块,加入适量PBS溶液轻轻的振荡,然后静置一段时间使组织块全部下沉,用吸管将混有红细胞和碎片的上悬液吸取出来,再加入PBS溶液,方法如上进行,重复多次,直至上悬液清澈为止。量取组织量的3-5倍的胰酶溶液,浓度为0.25%,37℃预热一段时间,加入到组织中,然后将其放在37℃温箱,每隔3 min轻轻摇动一次。大约进行10 min左右,将其从温箱中小心的取出,然后我们用吸管加入少量血清,目的是为了终止其消化。最后进行细胞脱落处理,我们将生长液加入其中,然后徐用粗口吸管轻轻的吹打多次,直到我们所需的细胞脱落分散。用4层纱布过滤到另一个烧杯中。将细胞进行计数,我们制备悬液,使用的方法是用生长液配成20万-40万/ ml细胞的溶液,将其分别装到培养瓶中,将培养瓶放到CO2培养箱中,进行37℃培养处理。 表达传染性法氏囊病毒VP2和法氏囊素三肽嵌合基因重组火鸡疱疹病毒的构建(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_22760.html
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