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一株新城疫基因VII型病毒的致病力的研究(2)

时间:2018-08-26 21:51来源:毕业论文
1 材料与方法 1.1 材料 种毒:GD/HZ/2015株为基因VII 强毒株,采集于15年广东某鸡场,已有诺倍威公司进行三次纯化。此毒株可以用来建立良好的攻毒模型,


1  材料与方法
1.1  材料
种毒:GD/HZ/2015株为基因VII 强毒株,采集于15年广东某鸡场,已有诺倍威公司进行三次纯化。此毒株可以用来建立良好的攻毒模型,评价疫苗的效果。同时,也可以通过反向遗传操作技术,进行基因改造后致弱,构建良好的新型疫苗株。
实验场地:37℃温室,动物房、研发实验室等。
实验仪器:隔离器,-80℃冰柜,超净台,PCR仪,电泳仪,凝胶成像仪等
实验动物:10日龄SPF鸡胚、21日龄雏鸡均由诺倍威公司提供。
1.2  方法
1.2.1 种毒的扩增
  该种毒采集于15年广东某鸡场,已经过三次纯化。取30枚10日龄的鸡胚,每一枚接种新城疫病毒0.1ml于尿囊腔,37℃温室培养,每24小时观察鸡胚存活情况。收集24~72小时存活鸡胚的尿囊液,4℃ 8000g/min离心5分钟,取上清,分装,于-80℃保存。
1.2.2基因VII型序列测定
 提取病毒RNA,用RT-PCR技术扩增出病毒的F基因进行进化分析。
1.2.3 鸡胚半数感染量(EID50)测定
  用PBS将各病毒尿囊液稀释至10-5,10-6,10-7.10-8,10-9浓度,尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml,每个稀释度接种10枚。接种后于37℃温室继续孵化,照蛋72h。每24小时照蛋一次,收集死亡鸡胚至4℃冰箱保存。检测鸡胚尿囊液HA活性,用Reed Muench法计算EID50。
1.2.4 攻毒实验
  取保存的尿囊液,由106ELD50/ml开始做10倍连续稀释至102,每一稀释度接种10只鸡。接种量0.1ml/只。经滴鼻点眼接种攻毒,分别隔离饲养。攻毒后连续观察14天。详细记录实验鸡的发病、死亡情况,对病死鸡进行剖检,取死鸡的脾脏,作病毒分离、鉴定。计算病毒半数致死量(LD50)。
2  结果与分析
2.1  实验结果
2.1.1 基因VII型序列测定
NDV基因的进化树可见附录1。
对F蛋白进行分子特征分析。F基因见附录2.
2.1.2鸡胚半数感染量(EID50)测定
  11月9日
  用PBS将种毒稀释至10-5,10-6,10-7.10-8,10-9浓度,接种于10日龄SPF鸡胚,每个浓度10枚,0.1ml/枚。于37℃温室培养 一株新城疫基因VII型病毒的致病力的研究(2):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_21961.html
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