2。2主要仪器

洁净工作台，常温和低温高速离心机，匀浆仪、海尔冰箱、核酸蛋白测定仪（基因有限公司）、梯度热循环仪（LongGen）、96孔照明板器（美国Thermo scientific）、PCR测定仪（美国Thermo scientific）、刀片、小镊子、EP管架

2。3方法

2。3。1 组织来源论文网

6-8周龄C57BL/6小鼠（饲养于杭州师范大学动物房）分为两组：正常饲料喂养组8只，给予正常浓度饲料饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，TP0035S）；蛋氨酸限制组8只，给予80%蛋氨酸限制饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，TP0035）。其中，正常浓度饲料和蛋氨酸限制饲料均为纯化型无胱氨酸饲料，除蛋氨酸含量分别为0。85%（0。85g/100g）和0。17%（0。17g/100g）外，其他成分相同。环境条件：温度控制在23±2摄氏度，湿度50±10%，昼夜循环光照12/12小时，自由进食相应饲料和水，饮水经过高温高压灭菌法处理，每周记录小鼠体重变化。给予实验饲料12周后，处死前禁食12小时，断颈法处死小鼠，收集心脏，做好标记，固定后冰冻切片-70℃冻存用于本实验。

2。3。2 RT-PCR测定心肌组织中TFEB相关靶基因的表达

（一）提取总RNA

本实验中SYBR荧光染料分子来定量检测基因表达产物，实验原理：在形成的整个PCR反应体系中，添加过量的SYBR荧光染料分子后，SYBR这个荧光染料分子会特异性地渗进DNA双链中，这时DNA双链会发射出荧光信号，而在没有渗进SYBR荧光染料的DNA双链由于没有相应染料不会发出任何相关荧光，因此在本实验中，每形成一个DNA双链分子，就会有荧光染料结合发出荧光，并且荧光的强度与DNA双链分子的总数量成正比关系。

利用TRNzol-A+ 总RNA提取试剂操作规范，提取切取的心肌组织中的总RNA。

    ①处理心肌组织：取新鲜的在-70℃冻存的小鼠心脏，用刀片小心切取100 mg心脏组织，然后迅速加入100ulTRNzol-A+，用匀浆仪快速将组织打8-10次碎成匀浆，由于心肌组织较硬，注意等到液体成匀浆之后再加入900ulTRNzol-A+，否则可能会造成组织资源浪费。文献综述

    ②将第一步取得的匀浆样品在冰上静置放置10min,使得心肌匀浆组织中的核酸蛋白复合物完全分离开来。

③两相分离：将匀浆样品中加200ul氯仿，盖好管盖，振荡器旋涡混匀15sec，发现液体混匀之后室温放置5-10min等待分层。 

④将上述分层后的液体轻轻地摆进离心机中，设定4℃ 12,000 rpm并离心5min。缓慢取出后可以发现样品会分成两层：下层黄色的有机相和上层无色的水相，两相之间有一层薄膜隔开，水相上层的体积大约是匀浆时加入TRNzol-A+试剂的60%。需要分离的RNA主要存留在上层水相，把水相（约450ul）分三次，也就是每次150ul转移到新的1。5ul离心管中，每次吸取上层水相时候注意不要触碰到两相之间的白色薄膜，否则会对后续实验测定造成干扰。

    ⑤RNA沉淀过程：实验转移后取得450ul的水相溶液之中混入等体积450ul异丙醇，两者混匀之后在室温下放置10min。