1。5实验方法

1。5。1培养基的配制

LB（固态）培养基：胰蛋白胨10 g、氯化钠5 g、酵母粉10 g、蒸馏水1000 mL、（琼脂20 g），将上述成分溶解定容，自然pH，分装，121℃灭菌20 min；

PDA（固态）培养基：去皮马铃薯200 g（切成小块煮沸30 min，用双层纱布过滤，取滤液）、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL、（琼脂20 g），将上述成分溶解定容，自然pH，进行分装，并在21℃下灭菌20 min；灭菌后，待培养基温度降至60℃左右时，加入0。3 g氯霉素，并混匀。文献综述

1。5。2取样

参照 GB/T4789。17—2003进行取样。用无菌剪刀在香肠表面3个不同部位各剪取0。2 g，均标记为“A”样品，分别放入3个灭菌研钵内，加灭菌石英砂研磨，磨碎后加入灭菌水20 mL，混匀并分别编号为“A1、A2、A3”。再分别吸取0。5 mL的混合菌液于4。5 mL无菌水中摇匀，即稀释了10倍。重复稀释操作，将混合液稀释100倍和1000倍，分别记为 “A1—10-3、A1—10-4、A1—10-5、A2—10-3、A2—10-4、A2—10-5、A3—10-3、A3—10-4、A3—10-5”。

采取与以上相同的方法，另外在香肠内部各取样0。2 g标记为“B”样品。并且将同时包含香肠外部和内部的0。2 g样品标记为“C”样品。

1。5。3菌种培养

将上述A、B、C样品，分别以不同的接种方式，接种至不同的培养基中培养：

（1）斜面培养：菌株分别在PDA斜面划线后，将培养基置于28℃培养箱中，恒温培养48h；在LB斜面划线后，将培养基置于37℃培养箱中，恒温培养24h。

（2）种子培养：分别挑取活化好的菌种，接入装液量为50 mL的PDA种子培养基， 28 ℃，150 r/min振荡培48h；接入装液量为50 mL的LB种子培养基，在37℃，150 r/min振荡培养24 h。

（3）涂布培养：分别取上述样品50 μL、100 μL、150 μL涂布到PDA和LB固体培养基表面，每种编号的样品采用2个平行样，倒置于相应温度（PDA为28℃、LB为37℃）的培养箱中培养24～48h。

1。5。4菌种分离 

在涂布平板上挑取不同颜色、形状的菌落分别在LB和PDA培养基上进行划线分离，培养1~2d，观察并记录菌落生长状况和纯化度，重复3～4次纯化过程，直至得到纯培养物。

1。5。5菌种鉴定来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

1。5。5。1革兰氏染色和镜检

首先用移液枪吸取10 μL混合菌液于取洁净的载玻片中央，进行涂片；然后用无菌镊子夹紧载玻片未涂菌液的部位，在酒精灯外焰处微微加热至干燥；待干燥后，再将载玻片快速的从酒精灯外焰处来回通过数次进行固定，将载玻片背面触及皮肤，以不觉过烫为宜（低于60℃），待冷却后进行染色。初染时，在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1~2滴，使染色液覆盖涂片，染色1~2min后，用蒸馏水小股水冲洗，直至洗下的水呈无色为止。再用100-1000 μL移液枪吸取约300 μL碘液滴在涂片薄膜上进行媒染，使染色液覆盖涂片染色约1min和水洗至流出的乙醇不现紫色为止，再滴加95%乙醇进行脱色，随即用水冲洗。最后在涂片薄膜上滴加番红液1~2滴，染色约1min，随即进行水洗并干燥，并将玻片置于电子显微镜下进行观察。