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鲫鱼贮藏过程中微生物菌相DGGE分析及其防腐保鲜(3)

时间:2018-07-20 23:00来源:毕业论文
1. 材料与方法 1.1 材料与试剂 鲜活鲫鱼(400g-500g/尾)若干,购于南京市苏果超市,产于太湖。 菌种Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4,为本实验室保藏。 营养肉汤


1.    材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活鲫鱼(400g-500g/尾)若干,购于南京市苏果超市,产于太湖。
菌种Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4,为本实验室保藏。
营养肉汤固体培养基:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂18 g、水1 000 mL,pH 7.0;平板菌落计数(PCA)培养基 北京陆桥生物技术有限公司。
MgO、硼酸、盐酸(均为分析纯)、甲基红、亚甲基蓝  国药集团化学试剂有限公司
1.2 仪器与设备
高压蒸汽灭菌锅 北京发恩科贸有限公司;5084R高速冷冻离心机  德国Eppendorf公司;PCR  扩增仪  美国艾尔特公司;Dcode DGGE电泳系统(配有凝胶成像系统)  美国伯乐公司;隔水式电热恒温培养箱  上海跃进医疗器械厂;拍击式均质机 法国Interscience公司; Orion* 3-Star型pH计 美国ORION公司。
1.3  方法
1.3.1 菌落总数的测定
将从超市购买来的新鲜鲫鱼迅速带回实验室,重击鲫鱼头部致死。在无菌条件下用灭菌过的剪刀分别取25 g鱼肉样品放于无菌的均质带中并加入225 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水;取10 g鱼鳃置于无菌均质袋中加入90 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水中。将待测样品放入均质机中均质2 min。
具体操作参照GB 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》。
1.3.2 挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)和pH值的测定
TVB-N按照GB/T 5009.44—2003《肉与肉质品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法进行测定。
pH的测定:取10 g样品加入100 mL的煮沸冷却后的蒸馏水浸提30 min,过滤后滤液使用经校正剂校正后的Orion* 3-Star型pH计进行测定。
1.3.3  提取DNA的样品处理
在无菌超净工作台中分别剪取鱼肉25 g置于装有50 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水的无菌均质袋中;鱼鳃10 g置于装有25 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理盐水的无菌均质袋中,均质2 min,使菌充分溶于生理盐水中。用200目绢布过滤后取滤液,加入25 mL生理盐水,滤液1 000 r/min离心10 min,去沉淀,去除固体杂质,滤液1 0000 r/min离心10 min,弃上清液,使DNA沉降,沉淀加入5 mL无菌双蒸水,10000 r/min离心10 min,去上清液,将沉淀悬浮于1 mL TE buffer 中置于-20 ℃条件下备用。
1.3.4  总DNA的提取
按照OMEGA公司细菌基因组 DNA 提取试剂盒的方法操作,提取1.3.3中提取的细菌DNA,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。
1.3.5  PCR扩增
参考陈慧斌等[ ]的方法采用PCR扩增鲫鱼鱼肉和鲫鱼鱼鳃中细菌菌群的16SrDNA V3区。 鲫鱼贮藏过程中微生物菌相DGGE分析及其防腐保鲜(3):http://www.youerw.com/shiping/lunwen_20010.html
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