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水稻外源基因NPTⅡ的定性及定量检测分析(2)

时间:2021-04-28 22:05来源:毕业论文
2 材料与方法 2.1 材料 阳性质粒DNA (含有NPTⅡ基因),待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。 2.2 试剂与耗材 DNA抽提试剂盒、定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl2、

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有NPTⅡ基因),待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl2、定量PCR所用2x GoldStar  TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备 

 普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化 

实验步骤如下:

(1)将水稻颗粒使用美的搅拌机(MJ-BL25B2)粉碎成粉末状,称取0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中,加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml),涡旋振荡1分钟,使其充分裂解。

(2)65℃孵育10分钟,期间涡旋混匀2~3次。

(3)加入130μl Buffer GF2,混匀,冰上孵育5分钟。

(4)将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中,14000rpm离心2分钟,收集滤液。

(5)将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。

(6)加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇),充分混匀。

(7)将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中,若一次不能加完                 溶液,可多次转入,10000rmp离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放入收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μl Buffer GW(使用前检查是否已加入无水乙醇),10000rpm 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。

(9)重复步骤8。

(10)12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。来~自^优尔论+文.网www.youerw.com/

(11)将吸附柱放到一个新离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水,室温放置2-5分钟,10000rpm离心1分钟,收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2引物序列

根据引物合成的原则,通过使用引物合成软件,分别合成定性及定量引物,引物序列详见下表。

2.4.3 PCR检测 

(1)定性PCR扩增

 PCR技术是一种体外扩增技术,在引物、模板DNA和C、G、A、T核苷酸存在的条件下,进行的聚合酶的酶促反应,通过酶促反应,使DNA片段在数量上呈指数增加的技术,使用该技术能在短时间内获得大量的特定基因片段。 本研究根据实验室的一贯实验习惯,采用25ul反应体系进行PCR扩增,

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