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油菜叶片4种DNA提取方法的比较研究(3)

时间:2021-04-15 21:29来源:毕业论文
2 实验方法 2.1 实验材料 普通油菜品种中双10号的叶片。 2.2 主要试剂 EDTANa2(乙二胺四乙酸二钠)(Biosharp)、SDS(十二烷基磺酸钠)(Biosharp)、CTAB(十

2  实验方法

2.1  实验材料

普通油菜品种“中双10号”的叶片。

2.2  主要试剂

EDTANa2(乙二胺四乙酸二钠)(Biosharp)、SDS(十二烷基磺酸钠)(Biosharp)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)(Biosharp)、氯仿:异戊醇(24:1)(AMERSCO)、异丙醇(AR,国药集团化学试剂有限公司)、乙酸钾(AR,国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇(AR,国药集团化学试剂有限公司)、氯化钠(AR,国药集团化学试剂有限公司)、β-巯基乙醇、蛋白酶K等。

2.3  实验仪器

Eppendorf各量程移液枪、上海精宏DK-S28水浴锅、Eppendorf5418台式离心机、Eppendorf5810R台式高速冷冻离心机、Eppendorf Biophotometer核酸蛋白测定仪、梅特勒FE20pH计、上海沪西85-1磁力搅拌器、BIO-RAD Gel Dox XR System凝胶成像系统文献综述

2.4  提取液的配置

2XCTAB缓冲液:100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

4mol/L NaCl

20mmol/L EDTA(pH8.0)

2ml/100mlCTAB

0.2ml/100ml β-巯基乙醇

SDS提取缓冲液:100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

500mmol/L NaCl

50mmol/L EDTA(pH8.0)

10mol/L β-巯基乙醇

1.5ml/100ml SDS

DNA提取缓冲液:10mmol/L Tris-HCl(pH8. 0)

0.4mol/L NaCl

2mmol/L EDTA(pH8.0)

2.5  提取方法

2.5.1  CTAB法

CTAB是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7mol/L)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1~0.5mol/LNaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB-核酸复合物再用70%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。

(1)称取100mg新鲜的油菜叶片加液氮研磨成粉末状。

(2)加入CTAB提取缓冲液500ml水浴30min。

(3)用2×CTAB提取缓冲液提取。来.自/优尔论|文-网www.youerw.com/

(4)加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次。

(5)上相加入2/3倍体积的预冷异丙醇,温和混匀,室温下放置15min以上。

(6)12000r/min离心10min,沉淀用75%乙醇洗一次。

(7)吹干后加ddH2O溶解DNA。

油菜叶片4种DNA提取方法的比较研究(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_73440.html
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