摘要：目的：探究蚂蟥肌肉组织和消化道组织单细胞制备的适宜条件。方法：采用胰蛋白酶消化法，先单因素考察胰酶浓度和酶解时间对蚂蟥消化道组织和肌肉组织单细胞得率的影响，再通过正交试验筛选最佳酶解条件。结果：单因素结果显示，消化道组织在0.2%酶浓度、10min酶解时间时单细胞得率最大；肌肉组织在0.3%酶浓度、10min酶解时间时单细胞得率最大。正交实验结果与单因素结果基本一致。本研究结果可为蚂蟥细胞水平研究及进一步从单细胞角度对其进行资源开发与利用提供基础技术参考。29473
毕业论文关键词：蚂蟥；单细胞；酶消化法；胰蛋白酶
Study on single cell preparation from tissues of Whitmania pigra Whitman
Abstract：Objective:To explore the appropriate conditions for the preparation of single cells from muscle tissue and the digestive tract of Whitmania pigra Whitman.Methods:Isolation of tissue cells was performed by trypsin digestion.With the index of single cell rate,we investigated the effect of enzyme concentration and digestion time by monofactor test and determined the optimum digestion process by orthogonal experiment.Results: The optimal preparation conditions of digestive tract were:0.20% trypsin,37℃,10 min. The optimal preparation conditions of muscles were:0.30% trypsin,37℃,10 min.The rate of single cells was highest under these conditions.The research can partly provide basically technique reference for cell level study of W.pigra ,and it is also basic research for development and utilization of resource of W. pigra.
Key words: Whitmania pigra Whitman；single cells；enzymatic digestion;trypsin
目  录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1实验材料与仪器 3
1.2实验方法 3
1.2.1试验用溶液的配制..3
1.2.2样品制备3
1.2.3单因素探究胰酶浓度3
1.2.4单因素探究酶解时间3
1.2.5正交试验3
1.2.6细胞计数方法4
2结果与分析4
2.1单因素试验结果4
2.1.1胰蛋白酶浓度对细胞得率的影响..4
2.1.2酶解时间对细胞得率的影响5
2.2正交试验结果..6
2.2.1消化道组织正交结果分析..6
2.2.2肌肉组织正交结果分析.7
3讨论 7
3.1酶消化法在单细胞制备中的应用.7
3.2不同组织细胞制备的差异.8
3.3细胞得率及细胞种类的差异..8
3.4小结与展望.9
致谢9
参考文献9
图1胰酶浓度对消化道组织细胞得率的影响4
图2胰酶浓度对肌肉组织单细胞得率的影响  4
图3酶解时间对消化道组织单细胞得率的影响..5
图4酶解时间对肌肉组织单细胞得率的影响.5
表5消化道组织各处理组合间的细胞得率比较6
表8 肌肉组织各处理组合间的细胞得率比较7
蚂蟥组织单细胞制备的研究
引言
蚂蟥（Whitmania Pigra Whitman），2015年版《中华人民共和国药典》[1]收载的药材水蛭三种动物基原之一，又称宽体金线蛭，隶属于蛭纲（Hirudinea）无吻蛭目黄蛭科[2]（Haemo pidae）。其干燥全体经炮制后入传统中药，具有破血通经、逐瘀消癥的功能，历来用于治疗血瘀闭经、症瘕痞块、中风偏瘫、跌打损伤[1]。水蛭中含有大分子类化合物，如水蛭素、肝素、组织胺、吻蛭素和氨基酸等；也含有糖脂类、蝶啶类、甾体类和羧酸酯类等多种小分子类物质。其药理作用主要有抗细胞凋亡、抗肿瘤、抗凝、抗血栓、抗炎、抗纤文化等[3]。临床研究表明，水蛭对心脑血管疾病具有很好的治疗作用，对肾病综合征、妇科疾病中的乳腺增生等也有很好的治疗作用[4-5]。
由于环境的污染及过度的自然捕捞，使得蚂蟥的自然资源逐渐减少至稀缺；而蚂蟥的人工养殖又面临着诸多问题，并未形成规模化产业，这些因素导致了蚂蟥的资源可利用量逐年减少，随之价格渐升，现蚂蟥的市场价格已达到200元/公斤。另外随着社会进展，人们生活水平的提高使得罹患心脑血管疾病的风险显著升高，而“通心络胶囊”、“脑心通胶囊”及“欣复康”等治疗心脑血管疾病的相关产品均以蚂蟥为原料，故对蚂蟥的需求也随之日益增长。目前，仅国内已有三十多家制药厂的产品是以水蛭作为其主要原料，年需求量达300多吨，加之其他消费市场，则全国年需求量达到700吨以上。。随着供求关系的日益不平衡，一方面需要开展蚂蟥的人工养殖研究以扩大供应，另一方面需要开展提高资源利用率的研究以降低需求总量。为了缓解人们对动物药日益增长的需求与日益减少的野生药用动物资源之间的矛盾，细胞培养在动物药生产中越发受到重视[6]。故从单细胞和细胞培养的角度利用蚂蟥是其资源开发的一新出发点，也是具有现实意义的探索研究。迄今为止未见有关蚂蟥细胞培养方面的文献报道，组织单细胞制备是进行细胞研究的第一步。本实验拟从蚂蟥消化道组织和肌肉组织单细胞制备条件入手，以期为蚂蟥细胞培养方面的研究提供基础资料。 蚂蟥组织单细胞制备的研究:http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_24740.html