2 材料与方法

2。1 材料

2。1。1 出发菌株 

诱变出发菌株为学院生物工程系实验室保存的里氏木霉菌株。

2。1。2 仪器来自优I尔Q论T文D网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766

LS-78HJ立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；

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GNP-9080隔水式恒温培养箱GNP-9080型：上海精宏实验设备有限公司；

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2。1。3 培养基

○1PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、MgSO4 0。5g、K2HPO4 1。5g、蒸馏水1000mL，pH自然。

○2查氏培养基：葡萄糖30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCl 0。5g、MgSO4·7H2O 0。5g，FeSO4·7H2O 0。01g，琼脂 15g，蒸馏水 1000ml，自然PH。

○3筛选培养基[8]：玉米半纤维10g，NaNO3  2g ，K2HPO31 g，KCl 0。5g，MgSO4 0。5 g，FeSO4 0。01 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1000ml，pH自然。

○4刚果红染液：取刚果红1 g，加水至1 000 ml使其充分溶解制成0。1％溶液。

○5发酵培养基：麸皮 1。00g，KH2PO4 2。00g，（NH4）SO4 1。4g，MgSO4 0。30g，CaCl2 0。34g，FeSO4·7H2O 5。00g，MnSO4·H2O 1。6g，ZnSO4·7H2O 1。4mg，CoCl2 2。00mg，定容到1L，pH值自然。

2。2菌种活化

将实验室保藏的菌种接种到PDA培养基上进行活化培养，培养温度28℃，培养时间2d~4d，然后接种到查氏培养基固体斜面。固体斜面上出面菌落时即可制备成菌悬液备用。

2。3方法论文网

2。3。1孢子悬液的制备

在出发菌株的成熟培养管中加入无菌蒸馏水制取孢子液，将其孢子用无菌刮铲轻轻刮下，并用玻璃珠打散充分振荡培养，过滤除去菌丝及成团孢子，取滤液采用血球计数板计数，将孢子悬浮液浓度控制为3。0×l07~3×l08个/mL（9）。

2。3。2 菌株诱变处理

2。3。2。1 ARTP等离子体诱变

以99。99％氦气作为工作气体，氦气流量10SLM，处理功率120W，样品与等离子体发生器出口距离2mm。选取出发菌株，按其制备孢子悬浮液。在超净台内制备载片，取10微升菌悬液均匀涂布于不锈钢载片上，等待片刻，放入ARTP诱变系统的载片口上进行等离子照射，分别处理60、120、180、240、300和360S，将ARTP诱变系统照射过的载片放入装有1ml无菌水的EP管内，振荡洗脱2min后，经过适当稀释，从中取100uL菌液均匀涂布于刚果红筛选培养基平板上进行活菌计数（10）。利用活菌计数法（CFU）计算致死率:致死率 % ＝（未经诱变处理菌落数 - 经诱变处理菌落数）/ 未经诱变菌落数 ×100%，每个处理组3个平行样（11）。

2。3。3 诱变菌种的筛选

出发菌株诱变后点于筛选培养基上，然后在28oC恒温箱中培养3d，之后加入适量0。1%的刚果红染液，染色lh，再用l mol／L的盐水清洗1h（12）。测量透明圈的大小，选取木聚糖水解圈与菌落直径之比较大的菌落，接种于斜面培养基上。培养2-3天之后再接种到发酵培养基中，将其置于30℃摇床中，培养72h之后测定其酶活。选取活力较高的菌株进行摇瓶液体发酵（13），将每一轮诱变所筛选到的酶活最高的突变株作为下一轮诱变的出发菌株。 产木聚糖酶里氏木霉的ARTP诱变育种(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_202268.html