1.2.2重组pMD18-T-LeCOI1载体的构建
参考TaKaRa pMD18-T Vector说明书中所提供的一般DNA片段的克隆方法，进行载体构建实验：取pMD18-T Vector(1μL)和已纯化的LeCOI1 DNA(4μL)，加入等量的Ligation Mix(5μL)，于16℃反应30min后加入100μL的DH5α感受态细胞中冰浴30min，42℃热激45s后冰浴1min，加入900μL的LB液体培养基37℃，活化培养1h后，于超净台中在加Kana的LB平板上进行涂布，过夜培养。第二天挑取阳性克隆，使用高纯度质粒小量快速提取试剂盒提取质粒。
1.2.3重组载体鉴定
取已提取的pMD18-T-LeCOI1阳性克隆的质粒为模板，使用LeCOI1序列扩增的PCR体系与反应条件(同1.2.1)进行PCR反应，同时以ddH2O代替重组质粒为模板进行PCR扩增作为对照实验。
使用1%琼脂糖凝胶电泳验证pMD18-T-LeCOI1重组载体是否构建成功，若PCR产物大小与目的基因大小相符，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。
1.2.4 pYY13质粒单酶切及纯化
取已保存的pYY13菌株提取质粒，取高质量的质粒进行PstⅠ单酶切反应，37℃水浴2h后，65℃水浴20min将酶灭活。经凝胶电泳检验后切得目的条带，使用试剂盒进行产物纯化。
1.2.5 pYY13-LeCOI1重组载体的构建
取已纯化的LeCOI1基因和单酶切后的pYY13质粒，分别加入T4 DNA聚合酶进行65℃(30min)，75℃(20min))水浴处理后对LeCOI1基因进行-A接头的连接(20μL体系：已纯化的LeCOI1基因10μL，dATP 2μL，10× T4 DNA polymerase buffer 4μL，T4 DNA polymerase 1μL，ddH2O 3μL)，对单酶切后的pYY13质粒进行-T接头的连接(20μL体系：纯化后单酶切pYY13质粒10μL，dTTP 2μL，10×T4 DNA buffer 4μL，T4 DNA polymerase 1μL，ddH2O 3μL)。取带有-A接头的LeCOI1基因5μL和带有-T接头的酶切质粒1μL进行混合，依次经22℃ 10min，75℃ 2min水浴后完成pYY13-LeCOI1重组载体的的连接。
目的基因的转化步骤与1.2.2相同。
1.2.6 pYY13-LeCOI1重组质粒的鉴定
取已提取的pYY13-LeCOI1阳性克隆的质粒为模板，使用LeCOI1序列扩增的PCR体系与反应条件本文来自优*文#论-文%网，
毕业论文 www.youerw.com 加7位QQ324~9114找原文(同1.2.1)进行PCR反应，同时以空pYY13质粒为模板作为对照实验。经1%琼脂糖凝胶电泳验证pYY13-LeCOI1重组载体是否构建成功，若PCR产物大小于目的基因大小相同，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。
2. 结果与分析
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