引言
茉莉素(jasmonates, JAs)为植物内新发现的内源性激素，在被子植物(烟草、拟南芥、优椒等)、裸子植物、蕨类植物以及藻类中[1-4]均有分布。其具有广谱的生理作用，不仅可以作为植物激素对植物的种子萌发和衰老、根的生长、花粉成熟和花药开裂、果实成熟、气孔关闭及植物储藏蛋白含量等生长发育方面产生调节作用[4-5]，还可作为内源信号化合物诱导防御基因的表达，参与植物对生物因子(如细菌、真菌、病毒和害虫等)侵害和非生物因子胁迫(如机械伤害、紫外损伤、干旱、高盐、低温)的防御信号响应[6-7]。茉莉酸甲脂(Methyl Jasmonate, MeJA)、茉莉酸(Jasmonic acid, JA)以及其他一系列具有相似生物活性的茉莉酸衍生物统称茉莉素。
COI1(coronatine-insensitive 1)为茉莉酸受体[8]，本文来自优*文#论-文%网，
毕业论文 www.youerw.com 加7位QQ324~9114找原文属于F-box蛋白，可与茉莉酸应答反应的抑制子结合，通过介导泛素降解反应[9]而调控植物的生长发育和抗逆性。COI1为拟南芥茉莉酸信号转导途径中所发现的第一个具有重要作用的基因[10]，它所编码的COI1蛋白含有两个特征性结构域：F-box结构域和富含亮氨酸结构域LRRs(Leucine-richre-peats)。COI1属于F-box蛋白，是茉莉酸受体，介导泛素降解反应[9-11]。COI1和转录抑制子JAZ1(JASMONATE ZIM-motif 1)相互作用可使JAZ被26S蛋白酶降解，从而允许茉莉酸依赖型转录的进一步进行[12-14]，通过对下游基因表达的开启进行下游茉莉素信号转导的调控[15]，对植物的生长发育及其抗逆性反应发挥作用。
据前人对拟南芥突变体coi1的研究资料显示，COI1与植物的育性和抗性性状有关[16]；有研究者发现沉默烟草COI1可降低植物对食草动物及病原体的抵抗能力[17]；对优椒CaCOI1研究则发现COI1在花的发育过程中起重要作用[18]。然而，有关LeCOI1基因所参与控制的JAs信号转导途径在番茄中的分子机制尚不清楚。本实验中以番茄(MoneyMaker, MM)为材料，采用反转录RT-PCR技术于番茄cDNA中克隆LeCOI1，并构建pYY13-LeCOI1载体，为后期研究番茄COI1蛋白的作用机理奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1实验材料、试剂与仪器
1.1.1实验材料
番茄植株MoneyMaker种子、pYY13菌株及大肠杆菌DH5α菌株均由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室保存，pMD18-T载体购自生宝生物工程有限公司。
1.1.2主要试剂
番茄植株RNA的提取所用试剂盒(RNApure Plant Kit)购自康为世纪生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒、LeCOI1基因克隆所用的2×Taq MasterMix及载体构建所用的dATP、dTTP、T4DNA聚合酶、限制性内切酶PstⅠ均购自于宝生物工程有限公司(TaKaRa)；高纯度质粒小量快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；其它试剂均由国产药品配制。
1.1.3主要仪器
温度梯度PCR仪购自德国Biometra公司，5180R型冷冻离心机和Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪均为德国艾本德(Eppendorf)公司产品，Tanon-2500型凝胶成像系统为上海天能科技有限公司产品，SW-CJ-2F型双人双面净化工作台为苏州净化设备有限公司产品。
1.2实验方法
1.2.1番茄RNA的提取、cDNA合成和LeCOI1的扩增
用RNApure Plant Kit试剂盒提取番茄植株的总RNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检验得到理想纯度RNA后，取1μg RNA为反转录模板，使用cDNA合成试剂盒(TaKaRa)对RNA产物进行反转录合成cDNA。
用已知的番茄(Solanum lycopersicum L.)LeCOI1基因的mRNA序列(AY423549)作为模板序列，利用Primer3.0在线软件进行引物设计，得到上游引物LeCOI1-L为CGACGACAAGACCCTCCTGGGGGCCTTACTGAT，下游引物LeCOI1-R为GAGGAGAAGAGCCCTGCTGGATGCTCCGAGACT，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成引物合成工作。
以番茄RNA反转录所合成的的cDNA为扩增模板，采用PCR技术进行LeCOI1的克隆。PCR体系(20μL体系)：DNA模板2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，2×Taq MasterMix 10μL，ddH2O 4μL。扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃再延伸5min。得到LeCOI1产物进行大量扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳分离并切胶得到目的条带，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收预期大小的扩增产物，置于冰箱4℃保存以备用。
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番茄LeCOI1基因的克隆与沉默载体的构建 第2页下载如图片无法显示或论文不完整，请联系qq752018766
