2。3。2  实时荧光定量PCR检测脂肪组织自噬相关基因 (组织蛋白酶B(CTSB)、蛋白LAMP1、SQSTM1、MAPLC3B和TFEB )mRNA 

2。3。2。1 RNA提取

 实时荧光定量PCR实验原理：在PCR反应体系的过程中，添加过量的SYBR Green荧光标记分子，SYBR Green这个荧光标记分子会特异性地渗进DNA双链中，使荧光信号强度与PCR产物量成正比，这时待测产物会相应发出荧光，而没有渗进SYBR Green荧光标记的DNA双链由于没有相应标记不会发出任何相关荧光，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出PCR产物量。在本实验中，SYBR Green染料一旦与双链DNA结合，荧光信号强度将大大增强，荧光的强度与DNA双链分子的数量成正比，因此，从而该荧光染料可用来实时监测PCR产物量的多少。

参照TRNzol-A+ 总RNA提取试剂操作规范，提取切取的附睾组织中全部RNA。

1）附睾脂肪组织处理：取新鲜的保存于-70℃的小鼠附睾脂肪组织，用刀片切取100 mg附睾组织放入离心管中，然后迅速在离心管中加入100ulTRNzol-A+，用匀浆仪多次快速将组织打碎，直至打成匀浆液体，为防止组织降解应迅速再加900ul TRNzol-A+。将取得的匀浆样品在静置10分钟,使得样本中的核酸蛋白复合物进行完全分离。

2）样品的分层：将混合均匀的样品中加入200ul氯仿，盖好管盖，振荡器旋涡混匀15秒，当液体混匀后室温静置5-10分钟等待分层，此步骤为提取RNA，舍去样本中的其他废弃组织。 

3）将分层后的样品缓慢放入离心机中，调整离心机为4℃ 12,000 rpm离心5分钟。取出后可以看出样品分成两层：下层为黄色的有机相和上层为无色的水相，两层物质被一层白色薄膜相分隔。所需提取的RNA主要存留在上层，把水相（约为450ul）分为三次，即每次150ul转移至新的1。5ml离心管中，每次吸取上层水相时候应注意不要触碰到分离两相间的白色薄膜，如吸取过程中不慎触碰到薄膜和下层有机相，此样本应废弃，重复之前的步骤提取新的样本。

  4）RNA的沉淀：在转移后得到的450ul的样品溶液中加入等体积异丙醇（即450ul），混匀后静置10分钟。

5）RNA的纯化：将样品放入离心机中（4℃ 12,000 rpm）离心10分钟，将纸巾按于离心管口小心倒置，弃去上清，并清理管口的废弃液。

6）RNA的洗涤：向离心管中加入0。5ml 75%乙醇（即加入35ml无水乙醇再加DEPC水至150ml进行配制）洗涤沉淀1次，此过程应缓慢进行，防止离心管底部的RNA样品倒出。

7）RNA的干燥：再次将样品放入离心机中（4℃ 12,000 rpm）离心10分钟，将纸巾按于离心管口小心倒置，弃去上清，并清理管口的废弃液，此过程应注意不要倒出在管底的胶状沉淀，所留下的少量液体进行快速离心，用枪头吸出多余废弃液，此过程在吸取时应注意不要触碰沉淀，以防止RNA被吸出，室温下将样品静置10分钟，晾干。

8）RNA的溶解：加入DEPC水100ul并将样品放入50℃恒温仪中，使沉淀充分溶解，放入-70℃冰箱中，待用于后续实验。

2。3。2。2 RNA质量检测

将冻存的RNA样品溶液解冻，先用移液枪吸取2ul DEPC水，滴于核酸蛋白测定仪，做RNA浓度测定的空白对照，后再用移液枪分别取2ul各样品RNA溶液分别做RNA测定，读取各样本的OD260/OD280比值，比值范围应为1。8到2。1，检测后将剩余的样品放入-70℃冰箱中保存待用。论文网

2。3。2。3 逆转录

参照快速反转录（FastQuant cDNA）第一链合成试剂盒说明，按照试剂盒的提供的方法进行操作。

1）实验试剂准备：解冻模板RNA，取出在-20℃冰箱中保存的5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、RNase-Free ddH2O 、10×Fast RT Buffer、RT Enzyme Mix ，在室温下解冻试剂，解冻完后将试剂置于冰上冷藏。 膳食蛋氨酸限制对小鼠脂肪组织自噬相关基因表达的影响(3):http://www.youerw.com/yixue/lunwen_191817.html