1．2．2贵阳腐霉游动孢子的观察

与接种野生型贵阳腐霉的方法相似，用灭菌医用针头将长有野生型贵阳腐霉的培养基划成约0。5cm²的若干小块，将其接种到液体培养基中，37℃培养三天。

三天之后，取出液体培养基，用灭菌的黄色枪头将琼脂块与菌丝体分开，尽量不要破坏菌丝体的结构。弃掉挑出的菌丝块并且将培养皿中的液体培养基倒掉，用无菌水浸泡淹没菌丝体，每30min换一次无菌水，一共换四次，贵阳腐霉的菌丝体逐渐由黄色变为白色。[16]此操作目的是洗掉培养皿中多余的营养成分，抑制其菌丝的生长，促进贵阳腐霉更快的产生游动孢子，利于观测。用无菌水洗好后将其放入37℃培养箱培养10小时。

10小时后，取出培养皿，吸取一滴培养皿中的水滴到载玻片的中央，先进行光学显微镜的观测。在40×物镜的视野下可以看到许多的游动孢子。这时，就可以用Dapi染色的方法，用稀释5000×的Dapi染色剂对载玻片上的游动孢子进行染色，而后利用倒置荧光显微镜观测游动孢子，游动孢子的细胞核在荧光下会发出蓝光，这样就可以比较清楚的看到野生型贵阳腐霉的游动孢子及其细胞核数量[17-20]。

1．2．3贵阳腐霉菌丝体的观察

取一块长方形滤纸，铺在托盘的底部。在托盘底部加少许无菌水，使滤纸完全湿润并紧紧贴合在托盘底部[21]。在托盘上放置干净，无菌的载玻片。按照接种野生型贵阳腐霉的方法，用灭菌医用针头在菌落边缘挑取0。5cm²左右的长有菌丝体的琼脂块，长有菌丝体的一面向下，放到载玻片中央[22-24]。用移液枪在载玻片中央的琼脂块上滴加一滴无菌水，使琼脂块湿润。然后用封口膜将托盘封住，放在37℃培养箱培养一天。

一天后取出托盘，用镊子小心将长出菌丝体的琼脂块夹出，注意不要破坏已经长到载玻片上的菌丝。用吸水纸小心吸取载玻片上多余的水，并用移液枪在载玻片上菌丝体处滴加一滴稀释5000×的Dapi染色液，盖上盖玻片，注意不要有气泡[25]。在倒置荧光显微镜上观察，可以看到菌丝体上被荧光染色的细胞核[26]。

1．2．4贵阳腐霉单核的筛选

筛选贵阳腐霉单核的方法是利用贵阳腐霉无性繁殖产生的游动孢子进行传代。贵阳腐霉的游动孢子较小，在观察贵阳腐霉游动孢子时，用移液枪吸取培养皿中存在游动孢子的溶液进行稀释[27]。由于它产生的游动孢子数因时间、培养条件的细微差异会有一些变化，我们设置了一些不同倍数的稀释梯度逐个在培养基上进行涂板，37℃培养一天后，观察贵阳腐霉的生长情况[28]。若出现单孢菌落（由一个游动孢子发育而来的菌落），则将其分离培养，观测其菌丝体及游动孢子是否存在全是单核的情况[29]。

1。 2。 5贵阳腐霉单核毒力测定

若试验可以筛选出单核的贵阳腐霉，那么它与野生型贵阳腐霉P。g的灭蚊活性可能会有一些差异。我们可以将单核的贵阳腐霉和野生型贵阳腐霉P。g的毒力进行比较，判断二者灭蚊活性的高低[30]。

首先，我们需要将单核贵阳腐霉与野生型贵阳腐霉分别在液体培养基中液培，按照无菌水诱导的方法，使它们产生游动孢子[31]。然后，每个培养皿里加入50头蚊虫幼虫，及时投放幼虫饲料，单核贵阳腐酶与野生型贵阳腐霉各做三个重复。每隔一天统计死亡的蚊虫幼虫数目，计算蚊虫死亡率[32]。

2  结果与分析

2．1 贵阳腐霉P。g的观测结果：

2．1．1贵阳腐霉p。g的游动孢子：   

贵阳腐霉P。g的游动孢子经Dapi染色后，在倒置荧光显微镜的一个视野里往往单核和双核并存（图1）。对于这种情况，我们采用数据分析和统计学的原理方法，设计三组重复试验，每组计数十个视野、共计三十个视野里贵阳腐霉P。g游动孢子单核与双核的数目，计算它的平均单核率（表1）。文献综述 贵阳腐霉单核的筛选(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96686.html