1材料与方法

1。1 样品

泥土、牛奶、酸奶、枯草芽孢杆菌168（含pUB110质粒）

1。2 培养基制备

1。2。1 LB培养基

胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加入去离子水定容至1 L。之后分装至锥形瓶中，加入1。5%的琼脂。以及加入卡那霉素的LB培养基（终浓度50 mg/L）。

1。2。2 GMI与GMII培养基

10×最低盐溶液：K2HPO4：28 g；KH2PO4：12 g；(NH4)2SO4：4 g；柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）：2 g；MgSO4·7H20：0。4 g，加入200 mL蒸馏水中。

L-trp溶液（2 mg/mL）：称取0。2 g色氨酸到100 mL蒸馏水中溶解，保存棕色试剂瓶内。

50%葡萄糖溶液：称取50 g葡萄糖溶于100 mL去蒸馏水中。

5%水解酪蛋白溶液：称取10 g水解酪蛋白溶于100 mL蒸馏水。

10%酵母液：称取10 g酵母粉溶于100 mL蒸馏水中。

0。5 M MgCl2溶液：称取10。165 g MgCl2·6H2O溶于100 mL蒸馏水中。

0。1 M CaCl2溶液：称取1。1099 g CaCl2溶于100 mL蒸馏水中。

以上所有试剂需经115 ℃灭菌30 min。

GMI溶液：1×最低盐溶液95 mL，50%葡萄糖1 mL，5%水解酪蛋白0。4 mL，10%酵母液1 mL，2 mg/mL L-trp 2。5 mL。总体积100 mL。

GMII溶液：1×最低盐溶液97。5 mL，50%葡萄糖1 mL，5%水解酪蛋白0。08 mL，10%酵母液0。04 mL，0。5 M MgCl2溶液0。5 mL，0。1 M CaCl2溶液0。5 mL，2 mg/mL L-trp溶液 0。5mL。总体积100 mL。

1。3 目标菌株分离与纯化

土壤中含有多种微生物，不同的环境中也有不同的微生物生存。一般来说，根据枯草芽孢杆菌是好氧菌这一特性，干燥的浅层土壤是适合其生存的环境。同时芽孢杆菌都具有一定的耐高温特性，所以分菌前的高温预处理有助于进一步筛选目标菌株。枯草芽孢杆菌属于益生菌，所以在牛奶酸乳制品中也存在。论文网

1。3。1  预处理以及梯度稀释

将采购的牛奶和酸奶样品，吸取3~4 mL至10 mL离心管中，按照样品的品牌不同做好标记。之后置于70 ℃水浴锅水浴20 min。挑取采集的泥土样质量为1 g至10 mL离心管中，加入去离子水稀释至5 mL的位置。按照所采集的地点方位做好标记。之后置于70 ℃水浴锅水浴20 min。

牛奶样品每份取3个1。5 mL离心管为一组，标记10-1、10-2、10-3，每管加入900 μL无菌水，稀释至10-2、10-3。酸奶样品由于较为粘稠，所以每份样品取5个1。5 mL离心管，标记10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，每管加入900 μL无菌水，稀释至10-4、10-5。泥土样取4个1。5 mL离心管，标记10-1、10-2、10-3、10-4，每管加入900 μL无菌水，稀释至10-3、10-4。每组吸取100 μL进行涂布，37 ℃培养过夜12个小时。

芽孢杆菌本身的耐高温特性，一般样品在70 ℃水浴锅中基本能杀死样品中绝大多数细菌。做两个梯度的平板涂布，可防止发生菌落数目过多无法辨别的情况。进一步的划线纯化是为了将所选菌落再培养出单菌落，以防止多种细菌混杂的情况。

1。3。2  筛选与保存

泥土采样方便快捷，共采样泥土23份，地点多为中山陵和玄武湖。泥土样的平板上菌落数目较多，根据有关枯草芽孢杆菌的文献，一般所圈出的菌落有以下特征：圆形、表面粗糙、白色、边缘不整齐、半透明或不透明[5]。

用灭菌后的接种环挑取所圈的疑似枯草芽孢杆菌的菌落，在新的LB培养基上划线培养，37 ℃培养过夜12小时。目的是分离出单菌落，进一步纯化菌落。牛奶和酸奶样品中的所有菌落都进行划线纯化。纯化后的菌落进行PCR鉴定。所用引物为16S rRNA基因及枯草芽孢杆菌特异性comK基因。将鉴定成功的菌株用40%的甘油-70 ℃保存，最终浓度为20%。 分离鉴定能形成自然感受态的枯草芽孢杆菌(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96685.html