1。5。5  大肠杆菌的转化

吸取10µL连接产物加入100µL的大肠杆菌感受态细胞，轻轻混合摇匀，冰浴30-45min。

42℃热激45s，然后冰浴2min。论文网

吸取100µL LB无抗液体培养基加入其中，放入37℃摇床中低速下恢复培养45min。

将菌液均匀涂布在含有LB（+Amp抗性）的培养基的平板上，在37℃下培养12h。

等待菌落长到肉眼可见时，每个培养皿上随机选取5个单菌落，用通用引物M13F/R进行菌液PCR验证。

挑取阳性转化子，送样到生物公司进行测序。测序完成后，用Blastx进行比对分析。

1。5。6  RNA提取[16] 

    取10~20mg菌丝体于800µLRNAiso plus剧烈摇匀，室温静置5min

    离心5min（12000g，4℃），小心吸取上清675mL移入新管加入135µl氯仿剧烈震荡15s，溶液充分乳化后室温静置5min。

    离心15min（12000g，4℃），管内溶液分三层，避开中间层吸取上清。

    上清与等体积的异丙醇上下颠倒混匀，在15~30℃下静置10min。

    离心10min（12000g，4℃），去上清留沉淀。

    沿管壁缓慢加入600µL70%乙醇。

    离心5min（12000g，4℃），倒去乙醇。

    冰盒干燥3min，由RNA-free(DEPC)H2O 30mL溶解5min。

电泳检测。

1。5。7  RNA中DNA的消化

50µL DNA消化体系如下：

10×DNaseI buffer             5µL

RNase-Free  DNaseI            2µL

RNA酶抑制剂（40U/µL）       0。5µL

RNA                          25µL

DEPC-ddH2O                  17。5µL

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总体积                        50µL

1。5。8  灵芝cDNA的制备

RNA反转录cDNA体系如下：

5×M-MLV Buffer                6µL

dNTPs（each 10 mM）            3µL

RNase Inhibitor（40 U/µL）   0。5µL

M-MLV（RNaseH-）              0。5µL

RNA样品                       20µL

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总体积                        30µL

在42℃反转录45min，在95℃变性5min，所得的cDNA在-20℃中保存。

1。5。9  实时荧光定量PCR[17]

依据待考察基因的cDNA全长序列设计Q-RT PCR引物，长度在20bp左右，退火温度（Tm）值在55℃至65℃，产物大小在100bp到200bp；引物结合模板特异性高。

Q-RT PCR体系：文献综述

SYBR Green I Mix              10µL

上游引物                     0。5µL

下游引物                     0。5µL

cDNA                           1µL

ddH2O                           8µL

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总体积                         20µL 灵芝中血红素加氧酶的基因克隆及其功能的初步研究(5):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_96684.html