1。2。2 半定量RT-PCR分析

从所有转基因植株的块茎中提取总RNA[5]，采用Thermo Scientific RevertAid First cDNA Synthesis Kit方法合成cDNA第一链，然后将新合成的cDNA第一链作为扩增模板，最后用Taq聚合酶进行PCR扩增。在检测转基因马铃薯中外源基因的mRNA积累量时，将非转基因的马铃薯作为阴性对照。

对转基因马铃薯进行RT-PCR分析所使用的引物和转化植株的PCR检测一样。PCR反应体系是：cDNA第一链反应液2μL，引物各1μL，2。5mM dNTPs 2μL，10×PCR反应缓冲液2。5 μL，Taq DNA聚合酶1μL，加不含RNase的双蒸水至总体积25μL。PCR反应程序是：94℃预变性2 min；94℃ 30s；52 ℃ 45s；72℃ 90s，35个循环；72℃延伸10min。作为内参的马铃薯actin基因的引物为5'-GGAG来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-TCTGGCATCATACAT-3'和5'- GTTGGAAGGTACTTAAAGAAGCC-3'，预期扩增片段长度为800 bp。PCR反应体系和glgB基因的扩增体系一样。PCR 循环参数是：94℃预变性2min；94℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 60s，30次循环；72℃延伸10 min。文献综述

1。2。3 马铃薯淀粉的提取

将每个转基因株系的5株马铃薯植株的薯块混合后，取0。5kg马铃薯洗净后，用小刀将皮削去，切成2-3 cm小块。用1 L含有0。1% Na2SO3的去离子水在组织匀浆机中进行匀浆。匀浆液经4层纱布进行过滤后，用2 L含0。1% Na2SO3的去离子水冲洗滤渣。滤液于4℃静置12h后去上清，淀粉沉淀用去离子水洗涤三次后平铺在滤纸上。最后将自然晾干的淀粉研磨成粉，即得到马铃薯淀粉。

1。2。4 转基因淀粉葡萄糖当量值(DE值)的测定

标准曲线的制作：分别取0、0。1、0。2、0。4、0。6、0。8、1。0mL 葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)于试管中，加ddH2O至1。0 mL。分别加入1mL DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid, 3,5-二硝基水杨酸)试剂，沸水浴中加热反应5min后，迅速冷却至室温。以空白管为对照，用分光光度计(T6新世纪)在540nm处测定吸光值。标准曲线的回归方程为：y=1。4436x+0。0057，R2=0。9996。

淀粉DE值的测定：准确称取50 mg转基因淀粉，加5 mL 0。5M NaOH溶液后，于90℃水浴锅中加热搅拌直至溶解。冷却至室温后用1M 盐酸调pH至4。0，然后定容至10 mL。取0。5mL淀粉样品于离心管中，每个样品重复三管，并加入10μL异淀粉酶(Sigma公司)，然后将淀粉样品放入40℃水浴锅中反应2h(期间不时摇匀)。将经异淀粉酶处理的淀粉样品转移到标记好的试管中，再加入490uL的去离子水和1mL DNS试剂，其后的操作同标准曲线。根据回归方程计算经异淀粉酶处理的淀粉样品中还原糖含量并计算淀粉的葡萄糖当量值(DE值)。

1。2。5 转基因马铃薯块茎中淀粉含量的测定来`自+优-尔^论:文,网www.youerw.com +QQ752018766-

标准曲线的制作：分别取0、0。1、0。2、0。4、0。6、0。8和1。0 mL葡萄糖标准液(0。1 mg/mL)于试管中，加ddH2O至1。0 mL。向每支试管中加1。0 mL 5%的苯酚溶液后再加5mL浓硫酸，摇匀并静置5 min后，于沸水浴中加热15 min。以空白管为对照，在490 nm处测定吸光值。标准曲线的回归方程为：y=0。0087x+0。004，R2=0。9987。

块茎中淀粉含量的测定：在块茎收获1周内，选取质量大于150g的马铃薯块茎为实验材料。称取100 g 洗净后去皮的马铃薯块茎于匀浆机中，用100mL去离子水进行匀浆。取5mL马铃薯块茎匀浆液，边搅拌边加入15mL 52%的高氯酸溶液，并继续搅拌10min。3000g离心10min后，将上清液转入容量瓶中，沉淀用15 mL 52% 高氯酸溶液再提取一次，合并提取液并定容至100 mL。取稀释100倍的提取液1mL，其后的操作同标准曲线。每个样品重复测定3次。