③样品管：对应酶液100 μl+柠檬酸缓冲溶液900 μl（pH4。8,50Mm），混匀；

酶液空白管：对应酶液100 μl+柠檬酸缓冲溶液900 μl（pH4。8,50Mm），混匀；

底物空白管：1 ml柠檬酸缓冲溶液（pH4。8,50Mm）

④将上述试管及pNPG溶液置于70℃水浴中预热2-3分钟，样品管及底物空白管加入1毫升pNPG溶液，混匀；酶液空白管加入1 ml柠檬酸缓冲溶液（pH4。8,50Mm）

⑤同时开始准确计时10 min，计时10 min后，向所有试管中均加入1 ml碳酸钠溶液（1 mol/L）终止反应混匀，拿出冷却至室温

⑥以底物空白为空白调零，在400 nm下比色，得到A400

⑦根据标准曲线换算成pNP的量，计算出酶活。

2。5  发酵条件的优化

2。5。1  接种量优化

以初始培养基为发酵培养基，调整接种量分别为1%、2%、4%、6%、8%、10%（w/v，OD值0。6），做好标记，在30℃，150 r/min的条件下摇床培养2-3天[13]，72小时后取出离心取上清测定β-葡萄糖苷酶酶活，以确定其最优接种量。

2。5。2  碳源优化

分别选取2%（w/v）浓度的稻草粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖作为碳源添加至初始培养基中[14]，以配制发酵培养基，均接入最适接种量的扩大培养后的菌液（OD值0。6），做好标记，在30℃，150 r/min的条件下摇床培养2-3天，72小时后取出离心取上清测定β-葡萄糖苷酶酶活，以确定其最优碳源。

2。5。3  碳源浓度优化

分别选取1%、2%、3%、4%、5%、6%（w/v）浓度的最优碳源添加至初始培养基中，以配制发酵培养基，均接入最适接种量的扩大培养后的菌液（OD值0。6），做好标记，在30℃，150 r/min的条件下摇床培养2-3天，72小时后取出离心取上清测定β-葡萄糖苷酶酶活，以确定其最优碳源浓度。

2。5。4  氮源优化

分别选取2%（w/v）浓度的硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨和酵母粉作为氮源添加至已确定最优碳源及最优碳源浓度的培养基中，，以配制发酵培养基，均接入最适接种量的扩大培养后的菌液（OD值0。6），做好标记，在30℃，150 r/min的条件下摇床培养2-3天[15]，72小时后取出离心取上清测定β-葡萄糖苷酶酶活，以确定其最优氮源。

2。5。5  氮源浓度优化

分别选取1%、2%、3%、4%、5%、6%（w/v）浓度的最优氮源添加至已确定最优碳源及最优碳源浓度的培养基中，以配制发酵培养基，均接入最适接种量的扩大培养后的菌液（OD值0。6），做好标记，在30℃，150 r/min的条件下摇床培养2-3天，72小时后取出离心取上清测定β-葡萄糖苷酶酶活，以确定其最优氮源浓度。

2。5。6  pH优化

基于以上实验，接种量、碳源及其浓度、氮源及其浓度均已确定，利用pH计调节磷酸缓冲液pH至4。0、4。5、5。0、5。5、6。0，分别加入由最优浓度的最优碳源、最优浓度的最优氮源配制而成的发酵培养基中，接入最优接种量的扩大培养后的菌液（OD值0。6），做好标记，在30℃，150 r/min的条件下摇床培养2-3天，72小时后取出离心取上清测定β-葡萄糖苷酶酶活，以确定其最优pH。

2。5。7  时间优化

基于以上实验，接种量、碳源及其浓度、氮源及其浓度、pH均已确定，最适发酵培养基的成分也已确定，在5个配制好的发酵培养基中接入最适接种量的扩大培养后的菌液（OD值0。6）做好标记，在30℃，150 r/min的条件下摇床培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h。每隔24 h取出发酵液离心取上清测定β-葡萄糖苷酶酶活，以确定其最优发酵时间。

3  结果与分析文献综述 重组马克斯克鲁维酵母产β-葡萄糖苷酶的发酵条件优化(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_89223.html