1.2.2 接种

在灭菌后的超净台上，取出消毒后的常山胡柚外植体，用消毒且冷却后的解剖刀将幼芽切成小块，用消毒且冷却后的剪刀将胡柚茎剪成长度为0.5~0.8 cm的小段，较为幼嫩的茎，为了避免组织被烫伤，可以用解剖刀小心切成0.4~0.6 cm的小段。用消毒且冷却后的解剖刀将处理后的叶片分成指甲盖大小（2~3 cm2），并在叶片上划出伤口。将处理好的材料接种到不同组合的MS培养基中，每瓶接种3~5个外植体。

1.2.3 幼胚离体培养

培养基：1升培养基需琼脂7 g，蔗糖30 g，加入不同浓度的6-BA。

在温度22 ± 2℃，光照1000~1200 lux条件下进行光照培养。根据外植体的生长情况，每25~45天将材料转移到新的培养基上，及时观察生长变化情况并拍照记录。定时清理培养室，避免菌种的衍生。若出现染菌现象，需及时将未感染的材料转移到新的培养基上，并对染菌材料进行灭菌处理。

2  结果与分析

每种实验因子接种20个外植体，选择不同时期，重复实验。培养基为MS添加不同浓度的植物激素。为保证营养物质充足，材料在每一种培养基上，每间隔30~50天，转接一次。

2.1 常山胡柚幼叶培养结果

在MS+6-BA不同浓度系列的培养基中接种幼叶后，培来.自>优:尔论`文/网www.youerw.com 养15天左右，少数叶片出现黄化死亡，大部分叶片出现卷缩现象，进一步培养后形成愈伤组织，极少数在叶片靠近茎生长的一端，直接形成新芽和新叶（表1和图1）。

在纯MS培养基中，叶片卷缩率为10%，随6-BA浓度的增加，呈现先增加后减少的趋势，在1.0 mg/L 6-BA浓度的培养基中，叶片卷缩率为实验组内最高，达到95%；在纯MS培养基中，黄化死亡率为10%，随6-BA浓度的增加，呈现先减少后增加的趋势，在1.25 mg/L 6-BA浓度的培养基中，叶片黄化死亡率为实验组内最低，无黄花死亡的叶片；在纯MS培养基中，叶片形成愈伤组织的比率为0，随6-BA浓度的增加，呈现先增加后减少的趋势，在1.5 mg/L 6-BA浓度的培养基中，叶片形成愈伤组织的比率为实验组内最高，达到75%；实验中培养的叶片，在含6-BA的培养基中没有直接形成丛生芽。

少数叶片的黄化死亡，可能是材料成熟程度过高，不利于脱分化；也可能是材料处理的时候剪刀、解剖刀等器材消毒后，冷却程度不够，剪叶片或划出伤口时将叶片组织烫伤，影响了组织对营养物质的吸收。

极少数在叶片靠近茎生长的一端，直接形成和新芽新叶，可能是由于叶片基段保留有芽原基或叶原基，且在材料处理过程中没有受到严重的损伤，得以大致保留下来，在适当的培养条件下，直接发芽或抽叶。