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模拟干旱对水稻种子萌发过程中抗氧化酶活性的影响(2)

时间:2021-04-26 22:30来源:毕业论文
2 材料与方法 2. 1 实验材料 供试水稻品种为成熟早、品质优良,增产潜力大、适应性广、稳产性好、容易脱粒、好栽培的常规粳稻镇稻99和粳型常规旱稻洛

2 材料与方法

2. 1 实验材料

供试水稻品种为成熟早、品质优良,增产潜力大、适应性广、稳产性好、容易脱粒、好栽培的常规粳稻“镇稻99”和粳型常规旱稻“洛稻998”。种子贮藏在15℃条件下保存备用。

2. 2实验处理

培养皿的处理:将36个培养皿洗净放入灭菌锅121℃灭菌20分钟,取出培养皿放进烘箱烘干,后取出培养皿待冷却后垫两层滤纸备用。实验分为六组(0,1,2,3,4,5),分别是水势为0,-0.1MPa,-0.2MPa,-0.4MPa,-0.6MPa,-0.8MPa[9],在培养皿上贴上标签,例如镇稻第一组则为ZD-0,第二组为ZD-1,以此类推洛稻。贴好标签后,向每个培养皿中加入50颗种子。

试剂的配制与添加:分别称取15.7g,23.92g,35.67g,44.738g,52.396g的聚乙二醇(PEG),溶于200ml的无菌水中,充分搅拌至无悬浮。按照标签,对应向培养皿中加入10ml配好的不同浓度梯度的PEG溶液。若培养皿中滤纸没有贴合培养皿底部而产生气泡,可用枪头将气泡赶出。

种子的培养与处理:将培养皿放进25℃的恒温箱中培养七天,在培养过程中定期检查并加水。七天后取出培养皿,用镊子去除根芽,将留下的种子放入试管保存于液氮中。取出20颗种子去壳,低温保存,操作动作要快,避免酶失活。文献综述

2.3 实验方法

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)

试剂的配制:0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):分别取A母液228.75ml,B母液21.5ml,用蒸馏水定容至1000ml,即pH7.8的0.05mol/L磷酸缓冲液。其中A母液即0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液的配制:取71.7g的 Na2HPO4.12H2O,充分溶解,用蒸馏水定容至1000ml ; B母液即0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液的配制:取31.2g NaH2PO4.2H2O,充分溶解,用蒸馏水定容至1000ml[6]。30μM EDTA-Na2 溶液:称取0.001g用MEDTA-Na2磷酸缓冲液定容至100ml。2.25mM 氮蓝四唑溶液:称取0.1840g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml,且避光保存。60μM 核黄素溶液:称取0.0023核黄素,用力氨酸缓冲液定容至100ml,避光保存。14.5mM甲硫氨酸溶液:取2.1637Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至1000ml。

酶液的制备:称取0.2g去壳的种子样品,洗净后置于预冷的研钵中(研钵放在冰上,并加入1.6ml pH7.8的磷酸缓冲液研磨成浆,后转入离心管,在4℃、12000rpm下离心20min,取上清液即酶液。

酶活性测定:分别取已经配好的Met溶液162ml,EDTA-Na2 溶液0.6ml,磷酸缓冲液5.4ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后摇匀,配制成反应混合液。在试管中加入30μl 酶液和3ml 反应混合液,并写好相应的编号。同时做两支对照管,其中一支只加缓冲液置于暗中,测定时用于调零用,另一支试管加30μl 磷酸缓冲液和3ml反应混合液,照光后测定作为最大光还原管。用不照光的试管为对照管调零,避光测OD560的值。酶活性计算:SOD总活性= [(Ack-AE)×V] /﹙1/2 Ack×W×Vt﹚。在方程式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW);Ack 光照对照管的吸光度;AE为样品管的吸光度;Vt为测量时的酶液用量(ml,30ml);W为样品鲜重(g,0.2g)[7]。来.自/优尔论|文-网www.youerw.com/

2.3.2 POD酶活性的测定 (愈创木酚法)

试剂的配制:分别取A母液123ml和B母液877ml充分混匀即为1000ml的0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0);取200ml 已配好的PBS,加入0.076ml液体愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入0.112ml 30%的H2O2,混匀即反应混合液,并置于冰箱中保存。

样品测定:以PBS为对照调零,取3ml 反应液并加入30μl酶液,每隔30s测定OD470值,测定时边加样变测定,测定前等待5s,并记录OD值。 模拟干旱对水稻种子萌发过程中抗氧化酶活性的影响(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_74428.html

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