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产多糖耐镉芽孢杆菌的筛选及其胞外聚合物的组成(3)

时间:2018-11-01 17:55来源:毕业论文
1.1.3 主要试剂与溶液 ① 葡萄糖标准溶液[8] 准确称取葡萄糖100 mg,倒入250 mL烧杯中,加入少量去离子水并用玻璃棒搅拌溶解后,转移至容量瓶,并多次


1.1.3  主要试剂与溶液
① 葡萄糖标准溶液[8]
    准确称取葡萄糖100 mg,倒入250 mL烧杯中,加入少量去离子水并用玻璃棒搅拌溶解后,转移至容量瓶,并多次用去离子水冲洗烧杯及玻璃棒,将清洗后的去离子水一并用玻璃棒引流至容量瓶中,加去离子水,定容至100 ml,即得1 mg/mL的葡萄糖溶液。用5 ml移液管准确移取5 mL的1 mg/mL的葡萄糖溶液,共移取10 mL至100 mL容量瓶中,加入去离子水定容至100 mL,摇匀后即得100μg/mL的葡糖糖标准溶液,标记备用。
② 苯酚溶液
准确称取苯酚90 g,倒入250 mL烧杯中,加入10 mL去离子水后一边加热一边用玻璃棒搅拌至溶液呈无色透明,即得90%苯酚溶液。用5 mL移液管准确移取90%苯酚溶液5 mL至100 mL棕色瓶中,加入去离子水45 mL,摇匀后即得9%的苯酚溶液,标记后备用。
④ 标准蛋白质溶液[9]
准确称量标准的牛血清白蛋白10 mg,倒入到250 mL烧杯中,并用玻璃棒搅拌溶解后,转移至容量瓶,并多次用去离子水冲洗烧杯及玻璃棒,将清洗后的去离子水一并用玻璃棒引流至容量瓶中,加去离子水,定容至100 mL,使最终试剂浓度为100μg/mL。盖上容量瓶塞,上下反复颠倒,使牛血清白蛋白溶液充分混匀。将配置好的牛血清白蛋白溶液转入到100 mL三角瓶中,标好标记后待用。
⑤ 革兰氏染液
草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液。
⑥ 50×TAE
Tris 121 g,冰醋酸28.55 g,0.5 M EDTA(pH 8.0)50 mL,ddH2O溶解并定容至500mL。
⑦ 重金属溶液
将CdCl2.2.5H2O配制成浓度为5 g/L的Cd2+母液。
1.1.4  主要仪器设备
37℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、振荡培养箱、无菌超净工作台、手提式灭菌锅、恒温水浴锅、涡旋震荡器、可见分光光度计、高速冷冻离心机,光学显微镜等。
1.2  实验方法
1.2.1   产多糖芽孢杆菌的筛选    采集来自南京栖霞上矿区农田土样,称取10 g土样加入90 mL去离子水,充分混匀后,80℃水浴30 min,置于摇床(160 r/min)上恒温(30℃)摇瓶培养。吸取1 mL菌悬液进行系列梯度稀释涂布,稀释梯度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,吸取10-3,10-4,10-5,10-6梯度下菌悬液各100 μL,涂布于含有100 mg/L镉(Cd)浓度的LB平板上,将平板置于30℃培养箱过夜培养。根据培养基中菌落表面及形态,挑选优尔株菌在LB培养基上进行分离纯化后,挑选单菌落于有氮培养基上划线,隔夜培养后,选出生长较好的三株菌低温保存。
1.2.2   菌株的菌落和菌落形态特征    将保存的菌株在LB培养基上划线得到单菌落,观察单菌落边缘形状、大小、隆起情况、表面形态、菌落颜色、透明度等情况。
1.2.3   菌株革兰氏染色    将菌株在LB平板上培养16 h,然后制片进行革兰氏染色。观察革兰氏染色情况并记录。
1.2.4   生长曲线的测定[10]    挑选低温保存的菌株于5 mL LB液体培养基试管中,摇床活化18 h。配置LB液体培养基,添加CdCl2母液,使Cd2+浓度梯度为50、80、100、120 mg/L(以纯Cd2+计),另以不含任何重金属离子的LB液体培养基作对照,将活化后的菌液按1%的接种量分别接种于上述培养基中,置于摇床(160 r/min)上恒温(30℃)摇瓶培养。在菌体胁迫培养过程中,每隔2 h,以LB液体培养基作对照,在波长为600 nm的紫外分光光度计下测其光密度值,绘制菌株在不同浓度重金属胁迫下的生长曲线。
1.2.5   胞外聚合物(EPS)的提取及组成测定   
① 胞外聚合物(EPS)的提取[11] 产多糖耐镉芽孢杆菌的筛选及其胞外聚合物的组成(3):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_25315.html
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