自噬体的形成是细胞自噬发生的关键步骤，这一步骤涉及的蛋白包括以下系统：自噬体组装位点(Phagophore assembly site，PAS)的组装骨架系统、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号系统、Atg9循环系统及泛素样蛋白结合系统。PIK3是一类重要的胞内信号调控分子，它通过对膜上磷酸肌醇进行磷酸化修饰调控细胞生理活动。Vps34是PIK3复合体的催化亚基。

SPO14编码的PLD能催化磷脂酰胆碱水解生成胆碱和磷脂酸(PA)。这些产物可经下游途径合成PE等物质，用于自噬体的形成[4]。PE是自噬体双层膜结构形成中不可缺失的成分。已有研究表明，在小鼠细胞中，细胞自噬可通过PLD途径调节，而PLD则在Vps34的下游起正调控作用[5]。此外，已有研究发现，在哺乳动物饥饿诱导的自噬过程中，PLD促进PAS的成熟并部分与LC3共定位。在小鼠细胞中药物抑制或去除PLD，自噬体膜延伸受阻，主要通过自噬途径降解的蛋白p62积聚，自噬过程受影响[6]。

联想到PLD在酵母中的同源蛋白Spo14，其是否对细胞自噬过程产生影响？另外，OSW1编码的蛋白定位于酵母纺锤体极体，它参与孢子形态建成，特别是参与了胞外壁的组装。OSW1缺失时，孢子发生不同步。因此，OSW1被认为在孢子形成的过程中起到了调节各建成阶段的作用。Spo14定位于前孢子膜上，因此，Spo14的定位需要Osw1[7]。Sma1，与Spo14和Osw1一样，在出芽过程中，对孢子壁的组装有重要作用。它同时被证明与Spo14互作[8]。本文将探讨Spo14及其相关蛋白缺失是否会对细胞自噬过程产生影响。

1  材料与方法 

1．1  材料

1．1．1 菌株与质粒 

       本实验用到的菌株和质粒见表1。

表1 菌株与质粒

Table 1 Strains and plasmids

菌株或质粒 别名 基因型 来源

菌株

YHY 915 SEY6210 MAT α ura3-52 leu2-3，112 his3-Δ200 [9]

trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 mel GAL

YHY2422 SEY6210，ura3::GFP-ATG8-URA3 本研究

YHY8253 SEY6211 MAT a ura3-52 leu2-3，112 his3-Δ200 [10]

trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 mel GAL

YHY9248 SEY6211, ura3::GFP-ATG8-URA3 本研究

YHY327 NSY524 MAT a 论文网

YHY328 NSY525 MAT α

质粒

YPH233 p1K-GFP-ATG8-406 [11]

1．1．2培养基   

固体培养基：YPD培养基、YPD+G418培养基、SD super培养基（配方见附录一）

液体培养基：YPD培养基、LB+Amp培养基、SD-N培养基、出芽培养基(SPO)（配方见附录一）。

1．1．3试剂

质粒小量抽提试剂盒；rTaq聚合酶；DNA Marker；潮霉素B(Hygromycin B)；遗传霉素(Genetin, G418)；DNA纯化试剂盒；蜗牛酶；ssDNA等。 

1．1．4仪器

PCR仪，恒温培养箱，水浴锅，微波炉，凝胶成像分析仪，琼脂糖水平电泳槽，电泳仪，超低温冰箱，紫外可见分光光度计，台式高速冷冻离心机，洗片机，制冰机，电子天平，荧光倒置相差显微镜，激光共聚焦显微镜等。 探讨酿酒酵母中磷脂酶D是否在细胞自噬中具有功能(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_101997.html