图2-3 正常基因组DNA提取的快速流程图
2.2.2.2临床样品石蜡组织DNA的提取
标准抽提步骤：毕业论文
http://www.youerw.com/ 脱蜡
①. 将包埋好的石蜡组织进行初步的人工脱蜡，刨去组织周围的石蜡，取出组织部分，用剪刀等工具对其进行刨削，使其成薄薄的碎木屑状；
②. 将屑状石蜡组织置于2 mL离心管中，加入1.8 mL 二甲苯，剧烈涡旋15 s，放置10 min，期间颠倒混匀2-3次；之后于10,000 rpm，离心3 min，弃去二甲苯溶液；
③. 重复步骤② 一次，若石蜡量较多，可重复2-3次；
④. 加入1.8 mL无水乙醇，涡旋15 s，放置5 min，期间颠倒混匀2-3次，于10,000 rpm离心机离心3 min；重复次步骤 1-3次；
⑤. 放置干燥，至无乙醇味。
DNA提取
①. 15-20 mg 脱蜡处理过的组织，加入200 μL TL 及20 μL PK，涡旋混匀，置于55℃水浴锅中消化处理过夜；
②. 置于90℃水浴锅中处理 50-60 min；
③. 加入5 μL RNA酶，室温静置10-30 min；10,000 rpm，离心4 min，去除杂质，取大约200 μL上清液，加入200 μL buffer BL，涡旋混匀；
④. 加入500 μL无水乙醇，混匀，过DNA柱；
⑤. 500 μL HB buffer洗涤一次；
⑥. 500 μL DNA wash buffer 洗涤两次；
⑦. 12,000 rpm，空甩干燥2 min；
⑧. 加入200 μL 70℃预热的Elution buffer洗脱。
图2-4 临床样品石蜡组织DNA提取的快速流程图
2.2.3引物的设计
根据 NCBI 数据库所查询已经报道过与癌症相关的 SNP 位点，结合临床测序结果分析，获得 7 个覆盖突变类型 90% 以上的突变热点。设计突变热点的所在外显子扩增引物，点突变引物和 ARMS-PCR 引物。
根据 NCBI 数据库所查询 p53 基因 5，7，8 号外显子序列，在相应外显子两侧的内含子上设计扩增引物。
点突变引物为一对 25-35bp 的互补引物，在引物中间引入准备突变位点。两则满足Tm 大于45的条件（Tm计算方式为：Tm=4×(GC碱基数)＋2×(AT碱基数)）
ARMS-PCR 引物是针对 p53 基因 5，7，8 号外显子上高突变率的位点 G>A 设计双错配碱基的ARMS-PCR 特异性引物，引物3′ 末端碱基必须落在突变的位置上，该碱基可以是与野生型基因序列完全互补，使突变型不匹配而无法扩增；也可以与突变型互补与野生型不匹配而无法扩增，且为了增加3′ 末端碱基差异的影响，一般也会在3′ 末端的倒数第三个碱基人为错配，从而形成对末位碱基敏感的特异性引物。
引物序列如表2-3所示，本实验使用的所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，均为色谱纯化级。原文请+QQ3249'114优.文^论,文'网
表2-3 引物序列
引物名称 引物序列(5′to3′) 扩增片段大小
P53exon5(301)F 5′ ACTCCCCTGCCCTCAACAAG 3′ 301bp
P53exon5(301)R 5′ CCTTCCACTCGGATAAGATGC 3′ 301bp
P53-157mut (G-T)F CCCGGCACCCGCTTCCGCGCCATGGC －
P53-157mut (G-T)R GCCATGGCGCGGAaGCGGGTGCCGGG －
P53-157(134)tF 5′ ACCCGCCAGGCACCCACT 3′ 134bp
P53-157(134)gF 5′ ACCCGCCAGGCACCCACG 3′ 134bp
P53-157(134)R 5′ TCGTCTCTCCAGCCCCAGC 3′ 134bp
P53-175mut (G-A)F GGAGGTTGTGAGGCACTGCCCCCACCATG －
P53-175mut (G-A)R CATGGTGGGGGCAGTGCCTCACAACCTCC －
P53-175(171)aF 5′ ATGACGGAGGTTGTGAGTCA 3′ 171bp
P53-175(171)gF 毕业论文
http://www.youerw.com/P53-175(171)R 5′ ATGACGGAGGTTGTGAGTCG 3′
5′ TTCCACTCGGATAAGATGCTG 3′ 171bp
171bp
P53exon7(453)F 5′ GAAGGAGAATGGCGTGAACC 3′ 453bp
P53exon7(453)R 5′ CTGAGTGGGAGCAGTAAGGAG 3′ 453bp
P53-245mut (G-A)F CAGTTCCTGCATGGGCAGCATGAACCGGAGGC －
P53-245mut (G-A)R GCCTCCGGTTCATGCTGCCCATGCAGGAACTG －
P53-245(162)aF 5′ TAACAGTTCCTGCATGGACA 3′ 162bp
P53-245(162)gF 5′ TAACAGTTCCTGCATGGACG 3′ 162bp
P53-245(162)R 5′ AGAAATCGGTAAGAGGTGGG 3′ 162bp
P53-248mut (C-T)F TGGGCGGCATGAACTGGAGGCCCATCCTC －
P53-248mut (C-T)R GAGGATGGGCCTCCAGTTCATGCCGCCCA －
P53-248(187)tF 5′ TGCATGGGAGGCATGATCT 3′ 187bp
P53-248(187)cF 5′ TGCATGGGAGGCATGATCC 3′ 187bp
P53-248(187)R 5′ GGATGTGATGAGAGGTGGATGG 3′ 187bp
P53-249mut (G-T)F GGCATGAACCGGAGTCCCATCCTCACCATC －
P53-249mut (G-T)R GATGGTGAGGATGGGACTCCGGTTCATGCC －
P53-249(183)tF1 5′ TGGGAGGCATGAACCGTTGT 3′ 183bp
P53-249(183)gF1 5′ TGGGAGGCATGAACCGTTGG 3′ 183bp
P53-249(183)R 5′ GGATGTGATGAGAGGTGGATGG 3′ 183bp
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