1.2.7 重组载体的测序鉴定
采用pMD18-T通用引物为测序引物，将重组质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
1.2.8 CaM序列比对和系统发育分析
首先，在NCBI中使用Blast搜索与其同源的序列，进而验证其是否为CaM基因。然后对CaM基因序列和其他同源序列进行比对分析其同源性，采用Clustal X(Raindy汉化版)软件中的Alignment程序对获得的所有序列进行划分、多重对位排列(Multiple alignments)。采用MEGA 3.1软件做近邻归群法分析，用自展法(Bootstrap)对所构建的系统发育树进行检测，自展重复次数设定为1000次>40%的支持强度，对其进行系统发育分析和进化树的构建。
2. 结果与分析
2.1 番茄白粉病菌gDNA的检测
利用改良的真菌gDNA提取方法提取番茄白粉病菌的gDNA，经分光光度计检测gDNA的质量，A260/280比值在1.8左右，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示条带清晰，表明所提取的真菌gDNA可作为模板用于PCR扩增(图1)。
图1 番茄白粉病菌总基因组DNA的电泳检测
注：M：DL5000 Marker，1：番茄白粉病菌gDNA
2.2 目的基因克隆的检测
本研究采用真菌CaM简并引物CaM/R和CaM/F为引物，以番茄白粉病菌gDNA为模板，PCR扩增番茄白粉病菌CaM基因，得到三条分别为950bp、644bp、300bp左右的基因片段(图2)。分别对这三个基因片段进行大量扩增并经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。将纯化产物与pMD18-T载体连接并验证本文来自优~文\论|文/网，毕业论文 www.youerw.com 加7位QQ324'9114找源文。
图2 番茄白粉病菌的CaM基因扩增电泳图
注：M：DL5000 Marker；1-2：番茄白粉病菌CaM基因
2.3 重组载体的PCR检测结果
分别以提取重组载体和纯水为模板进行PCR扩增。以重组载体为模板分别扩增出约950bp、644bp和300bp的条带，而阴性对照未扩增出任何条带(图3)。
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