1.3 培养基及培养方式[1]
1.3.1 培养基（ml）:
微量元素母液（1L）：MnSO4•H2O, 39.2mg; NaCl, 70mg; FeSO4•7H2O，7mg; CoCl2•6H2O, 12.8mg; ZnSO4•7H2O,7mg; CuSO4•5H2O, 10.92mg; Alk(SO4)2•12H2O, 0.7mg; H3BO4, 0.7mg; Na2MoO4•2H2O, 0.7mg; 氯乙酸，105mg.
无机盐液（g/L）：MgSO4•7H2O, 0.5g; (NH4) 2SO4•7H2O，3g; KH2PO4，1g;微量元素母液2ml.
1.4 样品的制备
1.4.1粗酶液的制备
过滤 培养60天后，将全部扩大培养基取出用6层纱布过滤，弃滤渣；取上清夜。
盐析 首先在粗酶液中添加固体（NH4）2SO4粉末至30%饱和度（16.4 g∕100mL），盐析过夜。
离心 离心（4℃、6000 rpm) 15 min，取上清液。
盐析 在上清液1350 mL中添加固体（NH4）2SO4粉末至75%饱和度（28.5g∕100mL）盐析过夜。
离心 离心（4℃、7500 rpm) 20 min，弃去上清液 ，取沉淀。
透析 将沉淀转移到透析袋内（截留量12-14KD），对预冷的蒸馏水透析。每隔2-3h换一次水，于4℃下透析3-4次。
1.4.2 酶的超滤浓缩
培养60d后，向培养物中按1：7的加入无菌dH2O，用接种铲将培养物分散，于4℃振荡浸提4h；用3层纱布过滤，弃滤渣，得上清液，我们取出100ml以备测酶的总活力；取上清夜，将上清液转移到超滤装置进行超滤浓缩，得液浓缩大约800ml, 取出一部分对其进行酶活力的测定，剩余的加入硫酸铵进行盐析。
1.5 硫酸铵沉淀
将得到的浓缩液先添加硫酸铵至30﹪饱和度，4℃进行盐析，每隔两小时换一次水，盐析一天，离心（4℃，7500rpm,20min）,弃沉淀，得上清液。将上清液的硫酸铵的饱和度调至75％，重复以上盐析过程，离心（4℃，7500rpm,20min），得沉淀。将所得的沉淀加少量的4℃的预冷水收集起来，透析，冷藏备用。
1.6 离子交换层析
装柱 首先用阴离子交换剂Sepharose-Q Fast Flow装制成一根1.6×20 cm柱，连接核酸-蛋白紫外检测仪和自动部分收集器。
平衡 上样前预先用20 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.5）平衡交换柱。
上样 用蠕动泵将经透析的原酶液以1 mL/min的速度加于交换柱上。
洗脱 上样完毕后原文请找腾讯752018766优,文-论'文"网http://www.youerw.com ，用同样的缓冲液洗柱，待OD280光吸收峰值回到基线后，用20 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.5）和由此溶液配制的1 mol/L NaCl对离子交换柱进行梯度洗脱（梯度溶液由梯度混合器获得，NaCl溶液的浓度由低到高），洗脱速度为1.5 mL/min，用自动部分收集器收集流出液，每3 min收集1管。
测定酶活 测定流出液的酶活性，合并具有同样酶活性的流出液，用（NH4）2SO4盐析（80%饱和度）各类流出液，离心（4℃，10,000g，20 min）收集沉淀。
透析 用少量蒸馏水溶解沉淀，再对蒸馏水进行透析。
浓缩 透析液经聚乙二醇（平均分子量＞17,000）浓缩后，作为下一步进行分子筛层析的样品.
2 结果
2.1 酶活测定
木质素过氧化物酶（Lignin peroxidases，LiPs, EC 1.11.1.14）活力的测定：按Tien和Kirk所描述的方法进行[10]。此类酶活力由测定其氧化藜芦醇为藜芦醛（ε310 ＝ 9,300 M-1cm-1）的最初反应速度确定。反应混合液含有25 mmol/L酒石酸缓冲液（pH 3.0）、 2.5 mmol/L藜芦醇、0.5 mmol/L H2O2和适量酶液，于25℃测定酶反应前3 min内在310nm吸光值的增加。酶促反应由加入H2O2后而启动。定义每分钟使1μmol/L藜芦醇氧化所需的酶量为1个活力单位（U）[12]。
木质素过氧化物酶酶活力计算公式如下：
U/L ＝ n × ΔA × 106 / 9,300 × 3
其中，n为酶液稀释倍数，ΔA为3 min内反应液在310nm处吸光值的变化值。
对浸提的酶液进行了酶活测定。说明此中培养基所产的木质素过氧化物酶是具有酶活的。 将透析液上样于Q-Sepharose F. F.层析柱，获得具有木质素过氧化物酶活性的组分。