λ-Red 重组又称ET重组，是利用λ噬菌体Red 重组酶将导入细胞的线性DNA 片段与染色体（ 或载体）的特定靶序列进行同源重组[5]。入Red区段包括3个基因：bet、exo和gam。Exo是核酸外切酶，bet编码的B蛋白，，Gam为 16 kD的多肽分子，在Red 同源重组过程中起着决定性的作用[6]。其一种方法是将λ-Red 基因克隆到低拷贝质粒，在诱导型启动子控制下适量表达。包含ParaB 启动子和exo、gam和bet三种基因片段的质粒由于质粒上具有核糖体结合位点，在阿拉伯糖诱导下Red 蛋白可以有效的转录表达，同时它还是一个温度敏感型复制子，当实验中不需要时可以不让其表达[7]。

转录信使RNA(tmRNA)是一个小的稳定的RNA分子，通常也被称作SsrA或10Sa RNAl31，由ssrA基因编码。转录信使RNA，小蛋白B介导的反式翻译是细菌的翻译质量控制系统。该系统可以直接修饰和降解一些蛋白质，这些蛋白质的生物合成停顿或被阻断，从而该系统可以拯救核糖体，这些核糖体滞留在3’端缺失终止密码子的mRNAs序列上[8]。

本研究以自行分离的E1为研究对象，对其基因ssrA进行突变，构建ssrA基因的突变株，进而为后续研究ssrA基因与APEC致病性之间的关系创造条件。 

2。 材料与方法

2。1 材料

2。1。1 菌株和质粒  论文网

质粒pKD3母液购于优宝生物生物公司，大肠杆菌感受态细胞(Escherichia  coli DH5a）、大肠杆菌E1野生株均由实验室冷冻保存。

2。1。2 试剂与耗材

PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成，T4 DNA Ligase(350U/μL)、PMD18-T Vector (50ng/μL)、10×T4 DNA Ligase Buffer均购于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；dNTPs(2。5mM)、DL5000 DNA Marker、Taq DNA Polymerase(5U/μL)、10×Taq酶反应缓冲剂购于北京佳兰生物科技有限公司；LB固体培养基、LB液体培养基；氨苄青霉素(100mg/mL) 氯霉素（25mg/mL），自己制备。

LB液体培养基：NaCl 2g 胰蛋白胨 2g 酵母粉 1g  加纯水定容至200mL

LB固体培养基：NaCl 2g 胰蛋白胨 2g 酵母粉 1g  琼脂3g 加纯水定容至200mL

提质粒P1：1M Tris-HCl（pH8。0）25mL  20% Glucose（1。11M） 45mL

          0。5M EDTA（pH8。0）20mL    dH20  910mL

          高压灭菌后4℃保存，每50mL加2mL的RNaseA（20mg/mL）

提质粒P2：10%SDS  50mL   2N NaOH   50mL   加灭菌水定容至500mL

提质粒P3：KOAc    147g   CH3COOH   57。5mL  加去离子水定容至500mL

         高压灭菌后4℃保存

2。1。3 仪器设备

PCR扩增仪（型号：GeneAmp®PCR System 9700）、无菌操作台、离心机、恒温水浴箱、纯水系统、微量移液器、天平、电泳槽、电泳仪、紫外凝胶成像系统、电转化仪。

2。2 方法

2。2。1 质粒pMD-T-ssrA：：Cat片段的获得

2。2。1。1 pKD3质粒的提取

在超净工作台中，将3µLpKD3宿主菌的母液加入1mL含有Cat（终浓度25µL/mL）抗生素的LB液体培养基的EP管中，37℃，180rpm，振摇避光培养过夜。

次日，EP管中应呈现浑浊。将过夜培养物三区划线，接种于含有Cat抗生素的LB平板上。37℃，避光培养12h后，挑取2~3个抗性单菌落接种于1mL含有Cat抗生素的LB液体培养基的EP管中，37℃，180rpm，振摇避光培养过夜。

EP管中应呈现浑浊，为获得pKD3的质粒，对隔夜摇床培养物用碱裂解法进行质粒的提取。

碱裂解法提取质粒步骤：

① 将隔夜摇床培养物在离心机中，9000rpm，离心1min文献综述 运用λ-RED重组技术构建APECE1株ssrA基因突变株(2):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_198059.html